Francisco, Mafalda Vaz
Phenylalanine hydroxylase (pah) enzymosomes : development of a nanosystem for enzyme substitution/replacement therapies / Mafalda Vaz Francisco ; orient. Maria Luísa Corvo, Ana Paula Leandro
Phenylalanine hydroxylase (pah) enzymosomes : development of a nanosystem for enzyme substitution/replacement therapies / Mafalda Vaz Francisco ; orient. Maria Luísa Corvo, Ana Paula Leandro . - Lisboa : NOVA Medical School, Universidade NOVA de Lisboa, 2023 . - 66 p. . -
. -
Resumo:
Uma atividade deficiente da fenilalanina hidroxilase humana (hPAH) resulta
em fenilcetonúria (PKU). Para prevenir o grave atraso psico-motor desenvolvido pelos
doentes, o tratamento deve ser iniciado o mais rapidamente possível após o
nascimento. Atualmente, a restrição dietética, a suplementação BH4 e a terapia de
substituição enzimática estão disponíveis. Os avanços tecnológicos na produção de
proteínas recombinantes impulsionaram o desenvolvimento de terapias de reposição
enzimática. Embora muito promissor, no caso da PKU a sua utilização implica a
preservação da atividade e estrutura 3D da hPAH, durante o processo de formulação.
Devido à instabilidade conformacional observada, a formulação da enzima
citoplasmática homotetramérica de 200 kDa como ingrediente farmacêutico ativo
(terapia de reposição enzimática; ERT) é um processo muito desafiante.
Enzimossomas de hPAH podem ser uma formulação desejável para usar como
ERT para o tratamento PKU. Neste sistema, a enzima é ligada ao lipossoma que
confere proteção contra a degradação, propriedades de longa circulação e menor
imunogenicidade.
Dados preliminares obtidos pelo grupo indicaram que a modificação de
resíduos de lisina de hPAH com N-succinimidyl S-acethylthioacetate (SATA) permitiu
a preservação da atividade. Neste trabalho, as condições de modificação da hPAH
foram otimizadas utilizando diferentes rácios molares de SATA:hPAH.
O estudo da hPAH modificado foi caracterizado relativamente à atividade
enzimática, termostabilidade e estrutura quaternária. Com o aumento do rácio molar
SATA:hPAH verificou-se uma diminuição da proteína recuperada com uma ligeira
diminuição da atividade enzimática acompanhada de uma mudança no estado de
oligomerização. Utilizando a condição selecionada, as condições de armazenamento
foram avaliadas e foi possível concluir que a enzima preservou a sua atividade e sem
perda significativa de proteína, e assim obtendo-se enzimossomas funcionais
Estudos futuros incluem, a otimização do processo de produção de
enzimosomas, que deve ser completamente estudada em termos de estabilidade e
eficácia para confirmar a manutenção das características funcionais
Phenylalanine hydroxylase (pah) enzymosomes : development of a nanosystem for enzyme substitution/replacement therapies / Mafalda Vaz Francisco ; orient. Maria Luísa Corvo, Ana Paula Leandro . - Lisboa : NOVA Medical School, Universidade NOVA de Lisboa, 2023 . - 66 p. . -
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Resumo:
Uma atividade deficiente da fenilalanina hidroxilase humana (hPAH) resulta
em fenilcetonúria (PKU). Para prevenir o grave atraso psico-motor desenvolvido pelos
doentes, o tratamento deve ser iniciado o mais rapidamente possível após o
nascimento. Atualmente, a restrição dietética, a suplementação BH4 e a terapia de
substituição enzimática estão disponíveis. Os avanços tecnológicos na produção de
proteínas recombinantes impulsionaram o desenvolvimento de terapias de reposição
enzimática. Embora muito promissor, no caso da PKU a sua utilização implica a
preservação da atividade e estrutura 3D da hPAH, durante o processo de formulação.
Devido à instabilidade conformacional observada, a formulação da enzima
citoplasmática homotetramérica de 200 kDa como ingrediente farmacêutico ativo
(terapia de reposição enzimática; ERT) é um processo muito desafiante.
Enzimossomas de hPAH podem ser uma formulação desejável para usar como
ERT para o tratamento PKU. Neste sistema, a enzima é ligada ao lipossoma que
confere proteção contra a degradação, propriedades de longa circulação e menor
imunogenicidade.
Dados preliminares obtidos pelo grupo indicaram que a modificação de
resíduos de lisina de hPAH com N-succinimidyl S-acethylthioacetate (SATA) permitiu
a preservação da atividade. Neste trabalho, as condições de modificação da hPAH
foram otimizadas utilizando diferentes rácios molares de SATA:hPAH.
O estudo da hPAH modificado foi caracterizado relativamente à atividade
enzimática, termostabilidade e estrutura quaternária. Com o aumento do rácio molar
SATA:hPAH verificou-se uma diminuição da proteína recuperada com uma ligeira
diminuição da atividade enzimática acompanhada de uma mudança no estado de
oligomerização. Utilizando a condição selecionada, as condições de armazenamento
foram avaliadas e foi possível concluir que a enzima preservou a sua atividade e sem
perda significativa de proteína, e assim obtendo-se enzimossomas funcionais
Estudos futuros incluem, a otimização do processo de produção de
enzimosomas, que deve ser completamente estudada em termos de estabilidade e
eficácia para confirmar a manutenção das características funcionais
