Pestana, Sara
Testing the role of extracellular vesicles in early left right patterning / Sara Pestana ; orient. Susana Lopes, Duarte Barral
Testing the role of extracellular vesicles in early left right patterning / Sara Pestana ; orient. Susana Lopes, Duarte Barral . - Lisboa : NOVA Medical School, Universidade NOVA de Lisboa, 2023 . - 255 p. . -
. -
Abstract Bilaterian animals, such as humans, are characterized by an external roughly mirror symmetry along the left – right axis that covers a pronounced internal asymmetric arrangement of the thoracic and abdominal organs. While external symmetry has been associated with health and beauty standards, the internal asymmetry may rely more on efficiency and functionality of the different physiological systems. The left – right asymmetry of visceral organs is established early on during embryonic development within a transient and specialized structure, commonly referred to as the left – right organizer (LRO). The LROs appear in many shapes and sizes, depending on the species, but a common feature in some vertebrates is the requirement of motile cilia. The movement of these tiny hair-like protrusions generate a directional fluid flow, that scales with the cube of cilia length, in order to become capable of triggering a differentiated response on the left side of the LRO. Such flow-dependent response involves Pkd2 channel activation and calcium signaling that subsequently drive the left sided expression of the Nodal signaling cascade. Nodal is a secreted protein that translates the asymmetries established at the LRO to the rest of the embryo, through the lateral plate mesoderm. As embryonic development evolves, at specific time points and locations along the anterior – posterior axis, Nodal induces the expression of genes involved in the formation of the heart, brain, gut and its derivatives, modulating the lateralization of these organs. With this work, we dedicated our efforts to understanding a few molecular and cellular steps missing in the establishment of the left – right axis within the LRO. In the Chapter 2, we explored how the fluid flow is sensed by the LRO cells. Between the two hypotheses in the field, one based on mechanosensing and other on chemosensing properties of the flow, we found that the number of extracellular vesicles is too low and variable to transport sufficient and efficiently a sidedness molecular signal towards the left sided LRO cells. Moreover, pharmacological impairment of distinct endocytic pathways did not impact on heart laterality arrangement. We also found out an upstream regulator of Notch signaling, syntenin-a, involved in the cell fate decision between motile and immotile cilia. We showed that syntenin-a loss-of-function severely affected the left – right axis development. By downregulating the levels of syntenin a, Notch signaling is activated increasing the expression of her12 and resulting in a higher number of immotile cilia, in concordance with our previous published data. We next described a potential molecular switch, downstream of Notch signaling, composed by the Rabconnectin complex. As this complex is known to promote V-ATPase assembly and consequently its activity, we inhibited the V-ATPase activity and we observed an increase in the number of motile cilia. Thus, suggesting that the link between Notch signaling and motile – immotile cilia ratio is through the modulation of pH. Lastly, in Chapter 3, we focused on the impact of ciliary dysfunction in the epithelial respiratory cells. We characterized the distribution pattern of several ciliary proteins in two siblings harboring a primary ciliary dyskinesia causing mutation on Zmynd10 gene. Recent studies showed that ZMYND10 is one of the cytoplasmatic factors responsible for stabilizing and driving axonemal dynein arm assembly. We showed here that outer and inner axonemal dyneins, that become mostly absent from the ciliary axoneme in Zmynd10 mutant respiratory ciliated cells, can sometimes enter the proximal part of the cilium. These results suggest that to a low extent the dynein arms can still assemble and be transported into the cilium in the absence of ZMYND10, thus opening an opportunity for small-molecule therapies that promote protein stability in primary ciliary dyskinesia disease management.
Resumo Os animais bilaterais, como os humanos, são caracterizados por uma simetria externa ao longo do eixo esquerda – direita que cobre um arranjo interno pronunciadamente assimétrico dos órgãos torácicos e abdominais. Enquanto a simetria externa tem sido associada a padrões de saúde e beleza, a assimetria interna pode depender maioritariamente da eficiência e funcionalidade da montagem dos diferentes sistemas fisiológicos. Esta assimetria esquerda – direita dos órgãos viscerais é estabelecida durante o desenvolvimento embrionário dentro de uma estrutura transiente e especializada, normalmente conhecida por organizador esquerda – direita. Os organizadores esquerda – direita aparecem em várias formas e tamanhos, dependendo da espécie, mas uma característica comum em alguns dos vertebrados é a existência de cílios. Os cílios são organelos compostos por microtúbulos que são projetados da superfície da célula. E estes podem ser móveis ou imóveis dependendo da presença ou ausência de proteínas motoras, as dineínas do axonema, que geram energia suficiente para mover o cílio. No caso do organizador esquerda – direita, os dois tipos de cílios estão presentes e desempenham funções distintas: os cílios móveis promovem um fluxo direcional do fluido existente no lúmen dos organizadores, cuja velocidade é proporcional ao cubo do comprimento ciliar, e os cílios imóveis são potencialmente responsáveis por detetar esse mesmo fluxo. Por conseguinte, a deteção do fluxo desencadeia uma resposta assimétrica nas células do lado esquerdo do organizador esquerda – direita, que é dependente do canal de cálcio Pkd2 localizado nos cílios. Assim, os iões de cálcio entram pelo cílio e ativam a libertação de mais iões dos organelos internos, o que resulta numa onda de cálcio propagada pela célula que, por sua vez, é necessária para iniciar uma cascada molecular de sinalização composta por Nodal e os seus inibidores. Nodal é um factor secretado da família TGF-β inicialmente expresso em redor do organizador esquerda-direita de forma simétrica. Um dos seus antagonistas expresso no organizador, Dand5, impede a propagação precoce e simétrica de Nodal para a placa lateral da mesoderme. Contudo, a onda de cálcio que se forma nas células do organizador promove a degradação de dand5, tornando-se assim o primeiro gene assimetricamente expresso e libertando Nodal da sua repressão especificamente no lado esquerdo do organizador. Consequentemente, Nodal é capaz de ativar a sua própria expressão na placa lateral da mesoderme do lado esquerdo e a expressão de um segundo inibidor, lefty1, na linha mediana, de forma a impedir que Nodal ative a sua expressão no lado direito. À medida que o desenvolvimento embrionário evolui, Nodal propaga-se pela mesoderme ao longo do eixo anterior - posterior, que em estadios e regiões específicas, leva à expressão de genes envolvidos na formação do coração, cérebro, fígado, pâncreas, entre outros, modulando a lateralização destes órgãos. Este campo da biologia do desenvolvimento tem evoluído bastante ao longo dos últimos anos, contudo algumas questões continuam em aberto. A forma como o fluxo é detetado pelas células do organizador esquerda – direita é uma delas. Historicamente, o campo está dividido em torno de duas hipóteses principais – o modelo quimiossensor e o modelo mecanossensor. Por um lado, o modelo quimiossensor propõe que o fluxo serve para transportar vesículas e moléculas sinalizadoras para o lado esquerdo, onde serão internalizadas pelas células do organizador. Por outro lado, o modelo mecanossensor baseia-se na força hidrodinâmica que o fluxo exerce sobre os cílios imóveis. Com este projeto de doutoramento pretendemos fornecer novos dados do mecanismo biofísico impulsionado pelo fluxo usando o organizador esquerda – direita do peixe-zebra como modelo animal. Inicialmente, dedicámo-nos a inspecionar as características moleculares das células do organizador e o conteúdo de fluído para inferir sobre as possíveis contribuições do modelo quimiosensor na deteção do fluxo de fluidos pelo canal Pkd2. Para tal, gerámos uma linha transgénica para quantificar e permitir o rastreamento de vesículas extracelulares dentro do lúmen do organizador e usámos uma nova configuração de micromanipulação para modificar o conteúdo do fluido do organizador. Os nossos resultados mostram que o número de vesículas extracelulares detetadas é muito baixo e variável para transportar um sinal molecular de lateralidade de forma eficiente para as células do organizador do lado esquerdo. Adicionalmente, a inibição farmacológica de vias endocíticas distintas não teve impacto na lateralidade do coração. De seguida, analisámos a regulação do número de cílios móveis e imóveis no organizador esquerda – direita. No peixe zebra, todos os cílios têm a ultra estrutura necessária para se moverem, contudo, apenas alguns cílios se tornam móveis. O nosso grupo tinha anteriormente descoberto que a decisão entre móvel e imóvel é feita pela via de sinalização de Notch. Com este trabalho, nós identificámos novos moduladores a montante e efetores a jusante da sinalização de Notch envolvidos neste processo. Mostrámos que a perda de função da syntenin-a afeta severamente o desenvolvimento do eixo esquerda – direita, uma vez que ativa a sinalização de Notch e a expressão do seu gene alvo, her12, o que resulta num número maior de cílios imóveis e por conseguinte num fluxo do fluído menor. Também descrevemos um potencial botão molecular, a jusante da sinalização de Notch, composto pelo complexo Rabconnectin. Uma vez que este complexo é conhecido por promover a montagem da V-ATPase e consequentemente sua atividade, inibimos a atividade da V ATPase e observámos um aumento do número de cílios móveis. Assim, sugerimos que a ligação entre a sinalização de Notch e a proporção de cílios móveis – imóveis se dá através da modulação do pH. Por fim, no Capítulo 3, focámo-nos no impacto da disfunção ciliar nas células epiteliais respiratórias. Caracterizámos o padrão de distribuição de várias proteínas ciliares em dois irmãos portadores de discinésia ciliar primária causada por uma mutação no gene Zmynd10. Estudos recentes mostram que ZMYND10 é um dos fatores citoplasmáticos responsáveis por estabilizar e conduzir a montagem do braço de dineína que constituí o axonema do cílio móvel. Mostrámos aqui que as dineínas externas e internas do axonema, que se tornam principalmente ausentes do cílio em células respiratórias mutadas no gene Zmynd10, podem, no entanto, entrar na parte proximal do cílio. Estes resultados sugerem que uma pequena porção dos braços de dineína conseguem ser montados e transportados para o cílio na ausência de ZMYND10, abrindo assim uma oportunidade para terapias com pequenas moléculas que promovam a estabilidade de proteínas na gestão do tratamento da doença de discinésia ciliar primária Extracellular Vesicles
Viscosity
Ciliary Motility Disorders
Academic Dissertation
Testing the role of extracellular vesicles in early left right patterning / Sara Pestana ; orient. Susana Lopes, Duarte Barral . - Lisboa : NOVA Medical School, Universidade NOVA de Lisboa, 2023 . - 255 p. . -
. -
Abstract Bilaterian animals, such as humans, are characterized by an external roughly mirror symmetry along the left – right axis that covers a pronounced internal asymmetric arrangement of the thoracic and abdominal organs. While external symmetry has been associated with health and beauty standards, the internal asymmetry may rely more on efficiency and functionality of the different physiological systems. The left – right asymmetry of visceral organs is established early on during embryonic development within a transient and specialized structure, commonly referred to as the left – right organizer (LRO). The LROs appear in many shapes and sizes, depending on the species, but a common feature in some vertebrates is the requirement of motile cilia. The movement of these tiny hair-like protrusions generate a directional fluid flow, that scales with the cube of cilia length, in order to become capable of triggering a differentiated response on the left side of the LRO. Such flow-dependent response involves Pkd2 channel activation and calcium signaling that subsequently drive the left sided expression of the Nodal signaling cascade. Nodal is a secreted protein that translates the asymmetries established at the LRO to the rest of the embryo, through the lateral plate mesoderm. As embryonic development evolves, at specific time points and locations along the anterior – posterior axis, Nodal induces the expression of genes involved in the formation of the heart, brain, gut and its derivatives, modulating the lateralization of these organs. With this work, we dedicated our efforts to understanding a few molecular and cellular steps missing in the establishment of the left – right axis within the LRO. In the Chapter 2, we explored how the fluid flow is sensed by the LRO cells. Between the two hypotheses in the field, one based on mechanosensing and other on chemosensing properties of the flow, we found that the number of extracellular vesicles is too low and variable to transport sufficient and efficiently a sidedness molecular signal towards the left sided LRO cells. Moreover, pharmacological impairment of distinct endocytic pathways did not impact on heart laterality arrangement. We also found out an upstream regulator of Notch signaling, syntenin-a, involved in the cell fate decision between motile and immotile cilia. We showed that syntenin-a loss-of-function severely affected the left – right axis development. By downregulating the levels of syntenin a, Notch signaling is activated increasing the expression of her12 and resulting in a higher number of immotile cilia, in concordance with our previous published data. We next described a potential molecular switch, downstream of Notch signaling, composed by the Rabconnectin complex. As this complex is known to promote V-ATPase assembly and consequently its activity, we inhibited the V-ATPase activity and we observed an increase in the number of motile cilia. Thus, suggesting that the link between Notch signaling and motile – immotile cilia ratio is through the modulation of pH. Lastly, in Chapter 3, we focused on the impact of ciliary dysfunction in the epithelial respiratory cells. We characterized the distribution pattern of several ciliary proteins in two siblings harboring a primary ciliary dyskinesia causing mutation on Zmynd10 gene. Recent studies showed that ZMYND10 is one of the cytoplasmatic factors responsible for stabilizing and driving axonemal dynein arm assembly. We showed here that outer and inner axonemal dyneins, that become mostly absent from the ciliary axoneme in Zmynd10 mutant respiratory ciliated cells, can sometimes enter the proximal part of the cilium. These results suggest that to a low extent the dynein arms can still assemble and be transported into the cilium in the absence of ZMYND10, thus opening an opportunity for small-molecule therapies that promote protein stability in primary ciliary dyskinesia disease management.
Resumo Os animais bilaterais, como os humanos, são caracterizados por uma simetria externa ao longo do eixo esquerda – direita que cobre um arranjo interno pronunciadamente assimétrico dos órgãos torácicos e abdominais. Enquanto a simetria externa tem sido associada a padrões de saúde e beleza, a assimetria interna pode depender maioritariamente da eficiência e funcionalidade da montagem dos diferentes sistemas fisiológicos. Esta assimetria esquerda – direita dos órgãos viscerais é estabelecida durante o desenvolvimento embrionário dentro de uma estrutura transiente e especializada, normalmente conhecida por organizador esquerda – direita. Os organizadores esquerda – direita aparecem em várias formas e tamanhos, dependendo da espécie, mas uma característica comum em alguns dos vertebrados é a existência de cílios. Os cílios são organelos compostos por microtúbulos que são projetados da superfície da célula. E estes podem ser móveis ou imóveis dependendo da presença ou ausência de proteínas motoras, as dineínas do axonema, que geram energia suficiente para mover o cílio. No caso do organizador esquerda – direita, os dois tipos de cílios estão presentes e desempenham funções distintas: os cílios móveis promovem um fluxo direcional do fluido existente no lúmen dos organizadores, cuja velocidade é proporcional ao cubo do comprimento ciliar, e os cílios imóveis são potencialmente responsáveis por detetar esse mesmo fluxo. Por conseguinte, a deteção do fluxo desencadeia uma resposta assimétrica nas células do lado esquerdo do organizador esquerda – direita, que é dependente do canal de cálcio Pkd2 localizado nos cílios. Assim, os iões de cálcio entram pelo cílio e ativam a libertação de mais iões dos organelos internos, o que resulta numa onda de cálcio propagada pela célula que, por sua vez, é necessária para iniciar uma cascada molecular de sinalização composta por Nodal e os seus inibidores. Nodal é um factor secretado da família TGF-β inicialmente expresso em redor do organizador esquerda-direita de forma simétrica. Um dos seus antagonistas expresso no organizador, Dand5, impede a propagação precoce e simétrica de Nodal para a placa lateral da mesoderme. Contudo, a onda de cálcio que se forma nas células do organizador promove a degradação de dand5, tornando-se assim o primeiro gene assimetricamente expresso e libertando Nodal da sua repressão especificamente no lado esquerdo do organizador. Consequentemente, Nodal é capaz de ativar a sua própria expressão na placa lateral da mesoderme do lado esquerdo e a expressão de um segundo inibidor, lefty1, na linha mediana, de forma a impedir que Nodal ative a sua expressão no lado direito. À medida que o desenvolvimento embrionário evolui, Nodal propaga-se pela mesoderme ao longo do eixo anterior - posterior, que em estadios e regiões específicas, leva à expressão de genes envolvidos na formação do coração, cérebro, fígado, pâncreas, entre outros, modulando a lateralização destes órgãos. Este campo da biologia do desenvolvimento tem evoluído bastante ao longo dos últimos anos, contudo algumas questões continuam em aberto. A forma como o fluxo é detetado pelas células do organizador esquerda – direita é uma delas. Historicamente, o campo está dividido em torno de duas hipóteses principais – o modelo quimiossensor e o modelo mecanossensor. Por um lado, o modelo quimiossensor propõe que o fluxo serve para transportar vesículas e moléculas sinalizadoras para o lado esquerdo, onde serão internalizadas pelas células do organizador. Por outro lado, o modelo mecanossensor baseia-se na força hidrodinâmica que o fluxo exerce sobre os cílios imóveis. Com este projeto de doutoramento pretendemos fornecer novos dados do mecanismo biofísico impulsionado pelo fluxo usando o organizador esquerda – direita do peixe-zebra como modelo animal. Inicialmente, dedicámo-nos a inspecionar as características moleculares das células do organizador e o conteúdo de fluído para inferir sobre as possíveis contribuições do modelo quimiosensor na deteção do fluxo de fluidos pelo canal Pkd2. Para tal, gerámos uma linha transgénica para quantificar e permitir o rastreamento de vesículas extracelulares dentro do lúmen do organizador e usámos uma nova configuração de micromanipulação para modificar o conteúdo do fluido do organizador. Os nossos resultados mostram que o número de vesículas extracelulares detetadas é muito baixo e variável para transportar um sinal molecular de lateralidade de forma eficiente para as células do organizador do lado esquerdo. Adicionalmente, a inibição farmacológica de vias endocíticas distintas não teve impacto na lateralidade do coração. De seguida, analisámos a regulação do número de cílios móveis e imóveis no organizador esquerda – direita. No peixe zebra, todos os cílios têm a ultra estrutura necessária para se moverem, contudo, apenas alguns cílios se tornam móveis. O nosso grupo tinha anteriormente descoberto que a decisão entre móvel e imóvel é feita pela via de sinalização de Notch. Com este trabalho, nós identificámos novos moduladores a montante e efetores a jusante da sinalização de Notch envolvidos neste processo. Mostrámos que a perda de função da syntenin-a afeta severamente o desenvolvimento do eixo esquerda – direita, uma vez que ativa a sinalização de Notch e a expressão do seu gene alvo, her12, o que resulta num número maior de cílios imóveis e por conseguinte num fluxo do fluído menor. Também descrevemos um potencial botão molecular, a jusante da sinalização de Notch, composto pelo complexo Rabconnectin. Uma vez que este complexo é conhecido por promover a montagem da V-ATPase e consequentemente sua atividade, inibimos a atividade da V ATPase e observámos um aumento do número de cílios móveis. Assim, sugerimos que a ligação entre a sinalização de Notch e a proporção de cílios móveis – imóveis se dá através da modulação do pH. Por fim, no Capítulo 3, focámo-nos no impacto da disfunção ciliar nas células epiteliais respiratórias. Caracterizámos o padrão de distribuição de várias proteínas ciliares em dois irmãos portadores de discinésia ciliar primária causada por uma mutação no gene Zmynd10. Estudos recentes mostram que ZMYND10 é um dos fatores citoplasmáticos responsáveis por estabilizar e conduzir a montagem do braço de dineína que constituí o axonema do cílio móvel. Mostrámos aqui que as dineínas externas e internas do axonema, que se tornam principalmente ausentes do cílio em células respiratórias mutadas no gene Zmynd10, podem, no entanto, entrar na parte proximal do cílio. Estes resultados sugerem que uma pequena porção dos braços de dineína conseguem ser montados e transportados para o cílio na ausência de ZMYND10, abrindo assim uma oportunidade para terapias com pequenas moléculas que promovam a estabilidade de proteínas na gestão do tratamento da doença de discinésia ciliar primária Extracellular Vesicles
Viscosity
Ciliary Motility Disorders
Academic Dissertation
