ABSTRACT: Leptospirosis is a worldwide emerging zoonotic infectious disease caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira. Rodents are the main reservoirs of this bacterium, spreading it through the urine into the environment, where they can survive weeks or months in freshwater collections and wet soils. It is therefore essential to know the geographical distribution of Leptospira spp., as well as its bacterial rate. Thus, in two districts of Portugal (Lisbon and Setubal), 327 water samples (lakes, rivers, public sources and drinking fountains), 96 soil samples and 139 biological samples (blood, urine, liver, kidney, lung and spleen) obtained from 18 rodents captured near the environmental sampling sites already mentioned. All samples (soil, water and rodent’organs) were submitted to genomic DNA extraction. For DNA amplification, two nested-PCR protocols were used, first with universal primers based on the rrs (16S) gene for the genus Leptospira and then with specific primers (pathogenic species) targeting the lipL32 gene. Some of the amplified products were sequenced and analyzed by BLAST. Universal primers detected leptospiral DNA in 49% (159+/327) of water samples, 83% (80+/96) of soils and in 44% (56+/127) of rodent samples. Rodent kidney and liver were the organs with the highest bacterial rate (65% and 67%) respectively. In turn, nested-PCR 'lipL32' amplified DNA from pathogenic leptospires in 35% of water samples (55+/159), 9% of soils (7 +/80), and in 79% of rodent samples (44+/56). The sequencing results showed the prevalence of two pathogenic species, Leptospira interrogans and L. borgpetersenii. These results confirmed the expected presence of pathogenic leptospires in rodents, but surprisingly also in freshwater collections and soils, whose environments may pose a health risk to populations exposed to such infectious agents in both professional and leisure activities.

RESUMO: A leptospirose é uma doença infeciosa zoonótica, emergente e de distribuição mundial, causada por espiroquetas patogénicas do género Leptospira. Os roedores são os principais reservatórios destas bactérias, disseminando-as no ambiente através da urina, onde podem sobreviver semanas ou meses em coleções de água doce e solos húmidos. É assim, importante conhecer a distribuição geográfica de Leptospira spp., bem como a respetiva taxa bacteriana. Assim, em dois distritos de Portugal (Lisboa e Setúbal), colheram-se 327 amostras de água (lagos, rios, fontes públicas e bebedouros), 96 amostras de solo, e 139 amostras biológicas (sangue, urina, fígado, rim, pulmão e baço) obtidas de 18 roedores capturados nas proximidades dos locais de colheita das amostras ambientais. Todas as amostras (solos, águas e órgãos/roedores) foram sujeitas a extração de DNA genómico. Para amplificação do DNA, usaram-se dois protocolos de nested-PCR primeiramente com primers universais, baseados no gene rrs (16S) para o género Leptospira, e depois primers específicos para espécies patogénicas, tendo como alvo o gene lipL32. Alguns dos produtos amplificados foram sequenciados e analisados por BLAST. Os primers universais detetaram DNA leptospírico em 49% (159+/327) das amostras de água, 83% (80+/96) das amostras de solo, e 44% (56+/127) nas amostras de roedores. O rim e o fígado foram os órgãos com maior taxa bacteriana (65% e 67%) respetivamente. Por sua vez, a nested-PCR ‘lipL32’ amplificou DNA de leptospiras patogénicas em 35% das amostras de água (55+/159), 9% dos solos (7+/80), e em 79% das amostras de roedores (44+/56). Os resultados da sequenciação mostraram a prevalência de duas espécies patogénicas, Leptospira interrogans e L. borgpetersenii. Estes resultados confirmaram a presença expectável de leptospiras patogénicas nos roedores, mas surpreendentemente também em coleções de água doce e solos, cujos ambientes podem constituir um risco para a saúde das populações expostas aos referidos agentes infeciosos quer em atividades profissionais quer de lazer.