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Detection and inhibition of β-lactamase activity in clinical isolates of Escherichia coli combining β-lactamase and efflux inhibitors using an MTT-based method: phenotypic and genotypic validation / Débora Carvalho Serra ; orient. Diana Machado, Miguel Viveiros

Main Author Serra, Débora Carvalho Secondary Author Machado, Diana
Viveiros, Miguel
Language Inglês. Country Portugal. Publication Lisboa : NOVA Medical School, 2020 Description xiii, 54 p. : il. Abstract ABSTRACT: Antimicrobial resistance is an ever-increasing threat in the era of modern medicine, of which resistance to β-lactams has become an urgent issue as they are the most common used antibiotics. Escherichia coli counteracts β-lactams with production of β-lactamases, however efflux mechanisms and porins have been known to contribute to this resistance phenotype. In this work, we aim to establish a costeffective colorimetric method for the fast screening of β-lactamases AmpC, extended spectrum β-lactamases (ESBLs), metallo-β-lactamases (MBLs), carbapenemases and the simultaneous presence of increased efflux activity in E. coli for routine use. The 27 E. coli clinical strains studied were typed by ERIC-PCR. Drug susceptibility was assessed by Kirby-Bauer. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of β-lactams were performed in presence and absence the following β-lactamase-specific inhibitors: cloxacillin for AmpC; clavulanate for ESBLs; EDTA for MBLs and boronic acid for carbapenemases. MICs of β-lactams were also performed in presence and absence the efflux inhibitors chlorpromazine, phe-arg-β-naphthylamide (PAβN) and carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) in combination with the β-lactamase-specific inhibitors. MICs were done using the 96-well plate microdilution method and MTT for colorimetric detection. The results were validated using the phenotypic standard methods for β-lactamases detection by disc diffusion and the screening of genes coding β-lactamases. β-lactamase production was detected in all clinical strains and included the presence of AmpC, TEM with OXA-1, SHV, or CTX-M or AmpC overexpression. We were able to reduce the MICs of β-lactams in the presence of the efflux inhibitors in combination with the β-lactamase-specific inhibitors demonstrating that despite the presence β-lactamases, the MICs of β-lactams can be reduced in the presence of efflux inhibitors. In this work we optimize a method for the simultaneous detection of β-lactamases AmpC, ESBLs, MBLs, carbapenemases and efflux activity. This method has the potential to be used in low-income countries since does not require expensive reagents nor specialized equipment. When used in association with a colorimetric reagent for the detection, as MTT, the interpretation of the results is straightforward being independent of the operator, avoiding false-negative as well false-positive results. Based on the results obtained, the synergistic effect observed between β-lactamase inhibitors and efflux pump inhibitors suggest the accumulation of β-lactams within the bacteria, thus potentiating their bactericide action.
RESUMO: A resistência aos antibióticos é uma ameaça cada vez maior na era da medicina moderna, na qual a resistência aos β-lactâmicos se tornou um tema premente uma vez que é a classe de antibióticos mais usada na clínica. Escherichia coli neutraliza os β-lactâmicos através da produção de β-lactamases, no entanto, a actividade de efluxo e redução da expressão de porinas também contribuem para este fenótipo de resistência. Neste trabalho, pretendemos optimizar um método colorimétrico económico para a detecção rápida de β-lactamases AmpC, β-lactamases de largo espectro (ESBLs), metallo-β-lactamases (MBLs), e carbapenemases, bem como a detecção simultânea de actividade de efluxo em E. coli para uso de rotina. As 27 estirpes clínicas de E. coli estudadas foram genotipadas por ERIC-PCR. A susceptibilidade aos antibióticos foi avaliada por Kirby-Bauer. As concentrações mínimas inibitórias (CMIs) dos β-lactâmicos foram determinadas na presença e ausência dos seguintes inibidores específicos de β-lactamases: cloxacillina para AmpC; clavulanato para ESBLs; EDTA para MBLs e ácido borónico para carbapenemases. As CMIs dos βlactâmicos foram também realizadas na presença e ausência dos inibidores de efluxo clorpromazina, “phearg-β-naphthylamide” (PAβN) e “carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone” (CCCP) em combinação com os inibidores de β-lactamases. As CMIs foram efectuadas usando o método de microdiluição em placa de 96 poços e MTT para detecção colorimétrica. Os resultados foram validados usando os métodos fenotípicos padrão para detecção de β-lactamases por difusão em disco e a detecção de genes que codificam βlactamases. A produção de β-lactamasesfoi detectada em todas as estirpes clínicas e incluiu a presença de AmpC, TEM com OXA-1, SHV, ou CTX-M ou sobrexpressão de AmpC. Foi possível reduzir as CMIs dos β-lactâmicos na presença dos inibidores de efluxo em combinação com os inibidores de β-lactamases demonstrando que, apesar da presença de β-lactamases, as CMIs dos β-lactâmicos podem ser reduzidas na presença de inibidores de efluxo. Neste trabalho, optimizámos um método para a detecção simultânea de β-lactamases AmpC, ESBLs, MBLs, carbapenemases e actividade de efluxo. Este método apresenta potencialidade para ser usado em países em desenvolvimento uma vez que é um método de fácil execução e não necessita de reagentes dispendiosos nem de equipamento especializado. Quando associado ao uso de um composto colorimétrico para a detecção, como o MTT, a interpretação dos resultados é directa uma vez que não está dependente do operador, evitando deste modo resultados falso-negativos bem como falsos-positivos. Baseado nos resultados obtidos, o efeito sinérgico observado entre inibidores de β-lactamases e inibidores de efluxo sugere um aumento da concentração de β-lactâmicos no interior da célula, aumentando assim a sua acção bactericida.
Topical name Escherichia Coli
Efflux Pumps
Efflux Inhibitors
Academic Dissertation
Portugal
Index terms Dissertação de Mestrado
Microbiologia Médica
NOVA Medical School
Universidade NOVA de Lisboa
2020
CDU 616 Online Resources Click here to access the eletronic resource http://hdl.handle.net/10362/97300
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Documento Eletrónico Biblioteca NMS|FCM
online
RUN http://hdl.handle.net/10362/97300 Available 20210051

ABSTRACT: Antimicrobial resistance is an ever-increasing threat in the era of modern medicine, of which resistance to β-lactams has become an urgent issue as they are the most common used antibiotics. Escherichia coli counteracts β-lactams with production of β-lactamases, however efflux mechanisms and porins have been known to contribute to this resistance phenotype. In this work, we aim to establish a costeffective colorimetric method for the fast screening of β-lactamases AmpC, extended spectrum β-lactamases (ESBLs), metallo-β-lactamases (MBLs), carbapenemases and the simultaneous presence of increased efflux activity in E. coli for routine use. The 27 E. coli clinical strains studied were typed by ERIC-PCR. Drug susceptibility was assessed by Kirby-Bauer. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of β-lactams were performed in presence and absence the following β-lactamase-specific inhibitors: cloxacillin for AmpC; clavulanate for ESBLs; EDTA for MBLs and boronic acid for carbapenemases. MICs of β-lactams were also performed in presence and absence the efflux inhibitors chlorpromazine, phe-arg-β-naphthylamide (PAβN) and carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) in combination with the β-lactamase-specific inhibitors. MICs were done using the 96-well plate microdilution method and MTT for colorimetric detection. The results were validated using the phenotypic standard methods for β-lactamases detection by disc diffusion and the screening of genes coding β-lactamases. β-lactamase production was detected in all clinical strains and included the presence of AmpC, TEM with OXA-1, SHV, or CTX-M or AmpC overexpression. We were able to reduce the MICs of β-lactams in the presence of the efflux inhibitors in combination with the β-lactamase-specific inhibitors demonstrating that despite the presence β-lactamases, the MICs of β-lactams can be reduced in the presence of efflux inhibitors. In this work we optimize a method for the simultaneous detection of β-lactamases AmpC, ESBLs, MBLs, carbapenemases and efflux activity. This method has the potential to be used in low-income countries since does not require expensive reagents nor specialized equipment. When used in association with a colorimetric reagent for the detection, as MTT, the interpretation of the results is straightforward being independent of the operator, avoiding false-negative as well false-positive results. Based on the results obtained, the synergistic effect observed between β-lactamase inhibitors and efflux pump inhibitors suggest the accumulation of β-lactams within the bacteria, thus potentiating their bactericide action.

RESUMO: A resistência aos antibióticos é uma ameaça cada vez maior na era da medicina moderna, na qual a resistência aos β-lactâmicos se tornou um tema premente uma vez que é a classe de antibióticos mais usada na clínica. Escherichia coli neutraliza os β-lactâmicos através da produção de β-lactamases, no entanto, a actividade de efluxo e redução da expressão de porinas também contribuem para este fenótipo de resistência. Neste trabalho, pretendemos optimizar um método colorimétrico económico para a detecção rápida de β-lactamases AmpC, β-lactamases de largo espectro (ESBLs), metallo-β-lactamases (MBLs), e carbapenemases, bem como a detecção simultânea de actividade de efluxo em E. coli para uso de rotina. As 27 estirpes clínicas de E. coli estudadas foram genotipadas por ERIC-PCR. A susceptibilidade aos antibióticos foi avaliada por Kirby-Bauer. As concentrações mínimas inibitórias (CMIs) dos β-lactâmicos foram determinadas na presença e ausência dos seguintes inibidores específicos de β-lactamases: cloxacillina para AmpC; clavulanato para ESBLs; EDTA para MBLs e ácido borónico para carbapenemases. As CMIs dos βlactâmicos foram também realizadas na presença e ausência dos inibidores de efluxo clorpromazina, “phearg-β-naphthylamide” (PAβN) e “carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone” (CCCP) em combinação com os inibidores de β-lactamases. As CMIs foram efectuadas usando o método de microdiluição em placa de 96 poços e MTT para detecção colorimétrica. Os resultados foram validados usando os métodos fenotípicos padrão para detecção de β-lactamases por difusão em disco e a detecção de genes que codificam βlactamases. A produção de β-lactamasesfoi detectada em todas as estirpes clínicas e incluiu a presença de AmpC, TEM com OXA-1, SHV, ou CTX-M ou sobrexpressão de AmpC. Foi possível reduzir as CMIs dos β-lactâmicos na presença dos inibidores de efluxo em combinação com os inibidores de β-lactamases demonstrando que, apesar da presença de β-lactamases, as CMIs dos β-lactâmicos podem ser reduzidas na presença de inibidores de efluxo. Neste trabalho, optimizámos um método para a detecção simultânea de β-lactamases AmpC, ESBLs, MBLs, carbapenemases e actividade de efluxo. Este método apresenta potencialidade para ser usado em países em desenvolvimento uma vez que é um método de fácil execução e não necessita de reagentes dispendiosos nem de equipamento especializado. Quando associado ao uso de um composto colorimétrico para a detecção, como o MTT, a interpretação dos resultados é directa uma vez que não está dependente do operador, evitando deste modo resultados falso-negativos bem como falsos-positivos. Baseado nos resultados obtidos, o efeito sinérgico observado entre inibidores de β-lactamases e inibidores de efluxo sugere um aumento da concentração de β-lactâmicos no interior da célula, aumentando assim a sua acção bactericida.

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