ABSTRACT: Primary immunodeficiencies (PIDs) constitute a heterogeneous group of congenital diseases that affect the development and/or the function of any component of the immune system. As any function of the immune system can be affected, patients with PIDs can present with recurrent infections or a higher specific susceptibility to certain microorganisms, but also with autoimmunity, lymphoproliferation, hyper-inflammation or even cancer. With the massive generalization of the next-generation sequencing (NGS) techniques, the discovery of new PIDs and novel genetic causes for previously known PIDs has been boosted. It is known that the vast majority of PIDs are monogenic, with variable expressivity and often with incomplete penetrance. The recognition that mutations in the same gene can present with several clinical phenotypes, but also that mutations in multiple different genes can manifest with the same phenotype, has made mandatory the use of NGS to elucidate the clinical picture of individual patients or patient groups. By understanding the impact of such nature's experiments on the immune system, it has been possible to expand knowledge, change therapeutic strategies and family counselling. This has led to a continuous change of the warning signs that can reveal PIDs. Adding to the infectious susceptibility, early onset autoimmune manifestations, polyautoimmunity, hyper-inflammation, or recurrent inflammation (systemic or organspecific), exuberant allergy (especially if associated with other manifestations), and even some neoplasms (such as juvenile myelomonocyte leukaemia), could be indications to investigate the presence of a PID. This thesis aimed to reveal new genetic and/or functional mechanisms of PIDs. Patients enrolled in this thesis were followed at the Primary Immunodeficiencies Unit of Hospital Dona Estefânia, Centro Hospitalar de Lisboa Central, having either a known PID that presented fatal and uncommon symptoms or an undiagnosed PID presenting atypical clinical symptoms. The investigation of these patients added new phenotypes to previously described PIDs: nodular regenerative hyperplasia in a patient with leaky X-linked severe combined immunodeficiency caused by a novel hypomorphic mutation in the IL2RG gene; hemophagocytic lymphohistiocytosis secondary to BCG and Cytomegalovirus infections in a patient with IFNγ receptor deficiency; inflammatory bowel disease (IBD) and a phenotype resembling tricho-entero-hepatic syndrome caused by a hypomorphic TTC7A mutation; cutis laxa in an APLAID patient caused by a novel mutation in the PLCG2 gene. The investigation of an Infantile-onset IBD cohort of patients allowed the identification of a monogenic cause for the disease in 54% of the patients and in many cases, this led to changes in the therapeutic approach. We were able to identify a novel cause of IO-IBD, immunodeficiency and sensoryneural immunodeficiency, caused by STXBP3 mutations, not previously associated with human disease. Moreover, in a patient presenting an IPEX-like phenotype we have identified a novel PID caused by homozygous mutations in the ZC3H12A gene, leading to a dysfunctional regnase-1 protein that caused aberrant post-transcriptional regulation of IL-6 production. Finally, in a patient with severe recurrent fasciitis we identified a variant of unknown significance in the IRG1 gene and aimed to prove that the IRG1 variant lead to altered itaconate metabolism in macrophages, thus resulting in inappropriate sensing of the resolution of the infection and hyperinflammation.

RESUMO: As imunodeficiências primárias (IDP) constituem um grupo heterogéneo de doenças congénitas que podem afetar o desenvolvimento e/ou a função de qualquer componente do sistema imunitário. Isto pode conduzir à alteração de qualquer uma das funções do sistema imune e portanto os doentes com IDP podem apresentar infeções recorrentes ou susceptibilidade especifica a determinado micro-organismo , mas também podem apresentar auto-imunidade, linfoproliferação, híper-inflamação ou até neoplasias. A recente generalização da disponibilidade das técnicas de sequenciação de nova geração permitu não só a identificação de genes responsáveis por IDP previamente descritas, mas também a descoberta de novas IDP. É sabido que a grande maioria das IDP são defeitos monogénicos que podem apresentar expressão e penetrância incompletas. O reconhecimento que mutações no mesmo gene podem conduzir a diferentes fenótipos, mas também que mutações em múltiplos genes diferentes podem conduzir ao mesmo fenótipo, tornou mandatória a utilização de técnicas de sequenciação de nova geração para elucidar os quadros clínicos destes doentes ou grupos de doentes. Ao compreendermos o impacto destas experiências da Natureza no sistema imunitário, foi possível não só expandir o conhecimento, mas também mudar condutas terapêuticas e o aconselhamento das famílias. Esta mudança de paradigma conduziu a uma necessidade continua de redefinir os sinais de alarme para a suspeição de IDP. Além da clássica susceptibilidade infeciosa, as manifestações auto-imunes de início precoce, a poliautoimunidade, a hiper-inflamação ou a infalamação recorrente (sistémica ou específica de órgão), a alergia exuberante (especialmente associada a outras manifestações), e até algumas neoplasias (como a leucemia juvenil mieolomonocítica) podem ser manifestações reveladoras de IDP. Esta tese teve como objectivo revelar novos mecanismos genéticos e/ou funcionais de IDPs. Para isso foram investigados doentes seguidos na Unidade de Imunodeficiências Primárias do Hospital Dona Estefânia, Centro Hospitalar de Lisboa Central, que tivessem uma IDP com sintomas incomuns e fatais ou uma IDP com sintomas atípicos que não permitisse estabelecer um diagnóstico genético definitivo. A investigação destes doentes permitiu adicionar novos fenótipos a IDP previamente conhecidas: hiperplasia nodular regenerativa num doente com imunodeficiência combinada grave causada por uma nova mutação hipomórfica no gene IL2RG; síndrome hemofagocítico secundário a infeções por BCG e Citomegalovirus num doente com deficiência do receptor do IFNγ; doença inflamatória intestinal e um fenótipo assemelhando-se ao sindrome trico-enterohepático causado por uma mutação hipomórfica do gene TTC7A; cutis laxa num doente com síndrome de APLAID causado por uma nova mutação do gene PLCG2. A investigação de um conjunto de doentes com doença inflamatória intestinal de início infantil (IO-IBD) permitiu a identificação de uma causa monogénica para a doença em 54% dos doentes e em muitos desses casos, isto conduziu a alterações terapêuticas. Pudemos descrever uma nova causa de IO-IBD, imunodeficiência e surdez neurossensorial, causada por mutações em STXBP3, que não tinha sido previamente associada a doença humana. Adicionalmente, num doente com um fenótipo IPEX-like, identificamos uma mutação homozigótica do gene ZC3H12A, codificando uma proteína Regnase-1 disfuncional condicionando uma regulação pós-transcricional aberrante de IL-6. Finalmente, numa doente com fasceites graves recorrentes, identificamos uma variante de significado incerto no gene IRG1 e provamos que essa variante conduz a uma alteração do metabolismo de ácido itacónico nos macrófagos, causando incapacidade de detectar adequadamente a resolução da infeção e conduzindo a hiperinflamação.