ABSTRACT: Helicobacter pylori (H. pylori) gastric infection in humans is one of the most common, but it is only related to pathology in less than 20% of the infected population. Most individuals remain colonized throughout their life because this bacterium is a microorganism highly adapted to the host, managing to outwit its defense mechanisms. The chronicity of the infection as well as the heterogeneity of the virulence of the strains of this microorganism, associated with certain genetic risk factors by the host, make certain individuals particularly susceptible to the development of gastroduodenal pathology. Although there is still a lot to investigate, the risk of developing peptic ulcer disease or even gastric cancer is unquestionably related to the molecular, histological and pathophysiological changes that this bacterium induces in the gastric mucosa. Infection with H. pylori triggers a sequence of changes in the gastric mucosa that begin with superficial gastritis that can progress to chronic gastritis, atrophic gastritis, intestinal metaplasia, dysplasia and, finally, gastric carcinoma. Intestinal metaplasia resulting from mucosal aggression by H. pylori, which is present in about 30% of infected individuals, can be considered a pre-neoplastic regenerative process that consists of transforming the gastric mucosa into an intestinal phenotype. When present, intestinal metaplasia represents an increased risk of developing gastric cancer. The chronicity of the infection and its increasing resistance to antimicrobials have been attributed not only to genetic variability, but also to the ability of this microorganism to form biofilms as well as the possibility of this bacterium entering a state of dormancy, or non-replication, as a strategy to overcome the adverse conditions in the environment. The different anti-H. pylori therapeutic regimens that are currently available, have several inherent problems, such as the presence of a high rate of resistance of this bacterium to various drugs in multiple geographic areas, the side effects of therapy and also, not least, difficulty in accessing it by certain population groups due to its high cost.Thus, new alternative therapies are needed, such as probiotics, peptides, polysaccharides and natural products, functional / nutraceutical foods, namely polyphenols including curcumin, which contribute to the modulation of the inflammatory response and consequently prevent (secondary prevention) the deleterious effects of H. pylori in the gastric mucosa. The objectives of this thesis were: 1) Develop an experimental model of chronic infection in the mouse, monitoring its evolution over time, without the need to sacrifice the animals; 2) Clarify one of the possible mechanisms that can contribute to the development of intestinal metaplasia in the gastric mucosa; 3) Check the inflammatory response induced by H. pylori in the gastric mucosa and its possible modulation by the nutraceutical curcumin; 4) Demonstrate that curcumin has the ability to inhibit cyclooxygenase-2; In this context, as a consequence of the activity developed by us, four original studies were elaborated which resulted in the corresponding publications. Study 1 (short description) The experimental work of chronic infection with H. pylori and monitoring of the infection over time was only possible with the adaptation to the mouse of the 13Curea breath test used in humans. This diagnostic method, developed by us in a pioneering way in the mouse, allowed us to confirm the maintenance of the bacteria in the gastric mucosa at any time during the experiment. This test proved to be quite sensitive (96%) and specific (85.7%), using the PCR technique as a standard, with the added advantage of not having to sacrifice animals throughout the entire experiment. Its development was fundamental for the elaboration of all the works that followed in this thesis. Study 2 (short description) The main molecular mediator of the transformation of gastric mucosa into intestinal mucosa is the transcription factor CDX2. Under normal conditions, CDX2 expression is restricted to the intestine, and can be ectopically expressed in intestinal metaplasia lesions not only in the stomach, but also in the esophagus and gallbladder. Both bone morphogenetic protein (BMP - bone morphogenetic protein) and H. pylori infection in gastric cell cultures are known to positively regulate CDX2 expression. Conversely, the expression of CDX2 can also be suppressed, with SOX2 being one of the possible candidates. In fact, in cultures of gastric carcinoma cells infected by H. pylori it has been shown that there is a decrease in the activity of SOX2, with the consequent increase in the activity of CDX2. Considering that H. pylori infection is the main triggering factor for the development of intestinal metaplasia in the stomach, in the present study it was demonstrated for the first time that this microorganism affects the expression and activity of the BMP signaling pathway. In fact, the activation of this signaling pathway increased the expression of CDX2 and reduced the expression of SOX2, thus contributing to the development of intestinal metaplasia. Study 3 (short description) As it happens in humans, H. pylori caused intense inflammation in the gastric mucosa of the infected mice, which was verified in the molecular and histological aspects. The experimental infection significantly increased the expression of several chemokines commonly involved in H. pylori-induced gastritis, such as CCL20, CCL5, CXCL1, CXCL10, CXCL11 and CCL25. Likewise, there was a significant increase in the expression of TNF-α, IL-6 and IL-1β in the infected mice. H. pylori infection also increased MyD88 expression as well as the vast majority of TLRs. The treatment of infected mice administered curcumin normalized the expression of all these mediators of inflammation induced by this microorganism. This work demonstrated that curcumin has evident anti-inflammatory properties by reducing inflammation of the gastric mucosa in an experimental model of chronic infection, at the histological and molecular level. Study 4 (short description) Cyclooxygenase-2 (COX-2) has been associated with increased cell proliferation of the gastric mucosa, and the uncontrolled increase in its expression may induce lesions in the gastric mucosa and consequent tumor growth. Infection with H. pylori increases the expression of COX-2, with a regression to normal levels, after eradication of this microorganism. With regard to nutraceuticals, its effect in reducing COX-2, may constitute an added value, avoiding the potential adverse side effects of the drugs commonly used in the inhibition of this enzyme, the NSAIDs. Thus, the use of nutraceuticals can be considered a promising strategy, especially in the context of secondary prevention. Our work studied the effect of a nutraceutical, curcumin, on the expression of COX-2 and demonstrated that its expression at the mRNA level and at the protein level was increased at 6, 18 and 24 weeks after inoculation with H. pylori. Curcumin treatment significantly reduced the expression of COX-2 in infected mice at all times of the experiment. From all of our work, we can conclude that the experimental model of chronic infection by H. pylori proved to be effective and the pioneering 13C-Urea breath test is a reliable method for confirming the infection of the mice and also for monitoring them throughout the trial period. We also demonstrated in a pioneering way that H. pylori infection affects the expression and activity of the BMP signaling pathway and that its activation increased the expression of CDX2 and reduced that of SOX2. This fact can definitely contribute to the development of intestinal metaplasia. In the same way, our experimental pioneering work, demonstrating “in vivo” the anti-inflammatory properties of curcumin in the context of chronic infection, showed that the consumption of polyphenols in the diet may constitute a therapeutic approach in controlling the deleterious effects of gastric inflammation caused by H. pylori. Based on the results obtained, we can speculate that supplementation with curcumin from the human diet may constitute a possible approach, in the context of the secondary prevention of gastric lesions induced by H. pylori, in areas of high prevalence of this infection without the deleterious effects of NSAIDs.

RESUMO: A infeção gástrica em humanos por Helicobacter pylori (H. pylori) é uma das mais comuns, mas apenas está relacionada com patologia em menos de 20% da população infetada. A maioria dos indivíduos permanece colonizada durante toda a vida porque esta bactéria é um micro-organismo altamente adaptado ao hospedeiro conseguindo ludibriar os seus mecanismos de defesa. A cronicidade da infeção bem como a heterogeneidade da virulência das estirpes deste microorganismo, associadas a determinados fatores de risco genéticos por parte do hospedeiro, fazem com que determinados indivíduos sejam particularmente suscetíveis ao desenvolvimento de patologia gastroduodenal. Apesar de haver ainda muito para investigar, o risco de desenvolver doença ulcerosa péptica ou mesmo cancro gástrico, está indiscutivelmente relacionado com alterações moleculares, histológicas e fisiopatológicas que esta bactéria induz na mucosa gástrica. A infeção por H. pylori, desencadeia uma sequência de alterações na mucosa gástrica que se iniciam com uma gastrite superficial e que pode progredir para gastrite crónica, gastrite atrófica, metaplasia intestinal, displasia e, finalmente, carcinoma gástrico. A metaplasia intestinal resultante da agressão da mucosa por H. pylori, que está presente em cerca de 30% dos indivíduos infetados, pode ser considerada um processo regenerativo pré-neoplásico que consiste na transformação da mucosa gástrica para num fenótipo intestinal. Quando presente, a metaplasia intestinal representa um aumento do risco de desenvolvimento de cancro gástrico. A cronicidade da infeção e a sua resistência crescente aos antimicrobianos têm sido atribuídas não apenas à variabilidade genética, mas também à capacidade deste microrganismo formar biofilmes bem como à possibilidade desta bactéria entrar num estado de dormência, ou de não replicação, como estratégia para superar as condições adversas do meio envolvente. Os diferentes regimes terapêuticos anti-H. pylori disponíveis atualmente, têm vários problemas inerentes, tais como, a presença de alta taxa de resistência desta bactéria a diversos fármacos em múltiplas áreas geográficas, os efeitos secundários da terapêutica e também, não menos importante, dificuldade de acesso à mesma por parte de determinados grupos populacionais devido ao seu elevado custo. Assim, são necessárias novas terapêuticas alternativas, como probióticos, peptídeos, polissacarídeos, alimentos funcionais/nutracêuticos, nomeadamente polifenóis onde se inclui a curcumina, que contribuam para a modulação da resposta inflamatória e consequentemente previnam (prevenção secundária) os efeitos deletérios do H. pylori na mucosa gástrica. Os objetivos da presente tese foram: 1) Desenvolver um modelo experimental de infeção crónica no ratinho, monitorizando a sua evolução ao longo do tempo, sem necessidade de sacrificar os animais; 2) Esclarecer um dos possíveis mecanismos que podem contribuir para o desenvolvimento de metaplasia intestinal na mucosa gástrica; 3) Verificar a resposta inflamatória induzida por H. pylori na mucosa gástrica e a sua possível modulação pelo nutracêutico curcumina; 4) Demonstrar que a curcumina tem a capacidade de inibir a cyclooxygenase-2; Neste contexto, como consequência da atividade por nós desenvolvida, foram elaborados quatro estudos originais de que resultaram as correspondentes publicações. Estudo 1 (descrição resumida) O trabalho experimental de infeção crónica com H. pylori e monitorização da infeção ao longo do tempo só foi possível com a adaptação ao ratinho do teste respiratório com 13C-ureia usado em humanos. Este método de diagnóstico, desenvolvido por nós de um modo pioneiro no ratinho, permitiu confirmar a manutenção da bactéria na mucosa gástrica em qualquer momento da experiência. Este teste mostrou ser bastante sensível (96%) e específico (85,7%), usando a técnica de PCR como padrão, tendo ainda a vantagem de não ser necessário sacrificar os animais ao longo de toda a experiência. O seu desenvolvimento foi fundamental para a realização de todos os trabalhos que se seguiram na presente tese.Estudo 2 (descrição resumida) O principal mediador molecular da transformação da mucosa de tipo gástrico em mucosa de tipo intestinal é o fator de transcrição CDX2. Em condições normais, a expressão de CDX2 encontra-se restrita ao intestino, podendo ser expressa de modo ectópico em lesões de metaplasia intestinal não só no estômago, mas também no esófago e na vesicula biliar. Sabe-se que tanto a proteína morfogenética óssea (BMP – bone morphogenetic protein) como a infeção por H. pylori em culturas de células gástricas regulam positivamente a expressão de CDX2. Em sentido oposto, a expressão de CDX2 também pode ser reprimida, sendo um dos possíveis candidatos o SOX2. Na verdade, em culturas de células de carcinoma gástrico infetadas por H. pylori foi demonstrado que há uma diminuição da atividade de SOX2, com o consequente aumento da atividade da CDX2. Tendo em conta que a infeção por H. pylori é o principal fator desencadeante para o desenvolvimento de metaplasia intestinal no estômago, no presente estudo demonstrou-se pela primeira vez que este micro-organismo afeta a expressão e atividade da via de sinalização da BMP. Na verdade, a ativação desta via de sinalização aumentou a expressão de CDX2 e reduziu a expressão de SOX2 podendo deste modo contribuir para o desenvolvimento da metaplasia intestinal. Estudo 3 (descrição resumida) À semelhança do que ocorre em humanos, o H. pylori provocou inflamação intensa na mucosa gástrica dos ratinhos infetados, o que se verificou nas vertentes molecular e histológica. A infeção experimental aumentou de modo significativo a expressão de diversas quimiocinas habitualmente envolvidas na gastrite induzida por H. pylori, como sejam a CCL20, CCL5, CXCL1, CXCL10, CXCL11 e CCL25. De igual modo verificou-se um aumento significativo da expressão de TNF-α, IL-6 e IL-1β nos ratinhos infetados. A infeção por H. pylori aumentou também a expressão de MyD88 bem como da grande maioria dos TLRs. O tratamento dos ratinhos infetados aos quais foi administrado curcumina normalizou a expressão de todos estes mediadores da inflamação induzida por este micro-organismo.Este trabalho demonstrou que a curcumina tem evidentes propriedades antiinflamatórias ao reduzir a inflamação da mucosa gástrica num modelo experimental de infeção crónica, a nível histológico e molecular. Estudo 4 (descrição resumida) A Ciclooxygenase-2 (COX-2) tem sido associada ao aumento da proliferação celular da mucosa gástrica, podendo o incremento descontrolado da sua expressão induzir lesões na mucosa gástrica e consequente crescimento tumoral. A infeção por H. pylori aumenta a expressão de COX-2, verificando-se a sua regressão para níveis normais, após erradicação deste micro-organismo. No que respeita aos nutracêuticos, o seu efeito na diminuição da COX-2, pode constituir uma mais valia, evitando os potenciais efeitos colaterais adversos dos fármacos habitualmente usados na inibição desta enzima, os AINE`s. Assim, a utilização de nutracêuticos poderá ser considerada uma estratégia promissora, principalmente no âmbito da prevenção secundária. O nosso trabalho estudou o efeito de um nutracêutico, a curcumina, na expressão de COX-2 e demonstrou que a sua expressão a nível de mRNA e a nível da proteína se encontrava aumentada à 6ª, 18ª e 24ª semanas pós inoculação com H. pylori. O tratamento com curcumina reduziu de modo significativo a expressão de COX-2 nos ratinhos infetados em todos os tempos da experiência. Dos trabalhos por nós efetuados podemos concluir que, o modelo experimental de infeção crónica por H. pylori demonstrou ser eficaz e o pioneiro teste respiratório com 13C-Ureia um método fidedigno na confirmação da infeção dos ratinhos e também na sua monitorização ao longo de todo o período de experimentação. Também demonstrámos de um modo pioneiro que a infeção por H. pylori afeta a expressão e atividade da via de sinalização do BMP e que a sua ativação aumentou a expressão de CDX2 e reduziu a de SOX2. Este facto pode contribuir definitivamente para o desenvolvimento da metaplasia intestinal. De igual modo, os nossos trabalhos experimentais, igualmente pioneiros, de demonstração “in vivo” das propriedades anti-inflamatórias da curcumina em contexto de infeção crónica, evidenciaram que o consumo de polifenóis na dieta poderá constituir uma abordagem terapêutica no controlo dos efeitos deletérios da inflamação gástrica provocada por H. pylori. Com base nos resultados obtidos, podemos especular que a suplementação com curcumina da dieta humana pode constituir uma abordagem possível, no contexto da prevenção secundária de lesões gástricas induzidas por H. pylori, em áreas de alta prevalência desta infecção sem os efeitos deletérios dos AINEs.