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The role of mitochondria in drosophila wound healing / Susana Isabel Pereira da Ponte ; orient. António Jacinto, Paulo J. Oliveira

Main Author Ponte, Susana Isabel Pereira da Secondary Author Jacinto, António
Oliveira, Paulo J.
Language Inglês. Country Portugal. Publication Lisboa : NOVA Medical School, 2020 Description xxxii, 179 p. : il. Abstract ABSTRACT: Epithelia form the barrier that protects our body against the external environment. An injury represents a challenge to barrier homeostasis and must be repaired efficiently to maintain epithelial integrity and function. Wound healing in different types of epithelia varies in complexity but encompasses a series of conserved responses. The wound triggers the release of molecules that signal to the surviving tissue, leading to a cascade of events that include an immune response, and coordinated changes in the cellular cytoskeleton and adhesion machineries to close the wound and restore epithelial integrity. Understanding the molecular mechanisms involved in these different steps is highly relevant from the biological and biomedical perspective. Embryonic tissues have a remarkable ability to deal with injury by closing the wounds in a quick and scarless manner. The lessons learned from this model system should be useful to improve the current therapeutics for wound healing complications in humans, such as chronic wounds. Embryonic wound healing relies on the formation of a contractile cable at the wound leading edge, formed by the actin and myosin cytoskeleton, that coordinates the collective tissue movement that brings the wound edges together and closes the gap. This process is coordinated with cell crawling, cellular rearrangements and shape changes, in order to close the wound without the involvement of cell proliferation. Mitochondria are pivotal organelles for cell survival. Known as the powerhouse of the cell due to their energy production capability, they also perform other critical cellular functions, such as the regulation of calcium and redox homeostasis and apoptosis. Mitochondria are dynamic organelles, being able to change their shape, number and localization to adapt to the cellular needs. These events are collectively termed mitochondrial dynamics and play an important role in modulating mitochondrial functions. Mitochondrial dynamics includes fusion and fission events, which modulate morphology; mitochondrial biogenesis and mitophagy, which regulate mitochondrial number and quality control; and mitochondrial trafficking, which controls the subcellular distribution of mitochondria in response to the cellular needs. Dysfunction in the molecular machinery that governs mitochondrial dynamics is associated with a plethora of human pathologies, such as cancer, and neurodegenerative and metabolic diseases. However, the role of mitochondria and mitochondrial dynamics in epithelial repair in vivo has so far not been investigated. In this work, we took advantage of genetically-encoded fluorescent markers, high-resolution imaging and advanced laser ablation techniques to understand the contribution of mitochondrial dynamics to epithelial repair in vivo, in the Drosophila embryonic epidermis. Using a genetic screen assay, we identified proteins involved in mitochondrial fission, fusion and trafficking as novel wound healing regulators. In vivo live imaging of the wound closure process revealed that Dynamin related protein 1 (Drp1) and Optic Atrophy 1 (Opa1) proteins, that are central players in mitochondrial fission and fusion, respectively, regulate calcium and actin cytoskeleton dynamics during wound healing. Moreover, we showed that wounding induces changes in mitochondrial morphology in the cells facing the wound, suggesting that the injury induces mitochondrial fission. We found that Drp1 loss of function leads to defects in both cytosolic and mitochondrial calcium dynamics upon wounding. Calcium ions are important second messengers in a myriad of signalling pathways and key players in the most important wound healing events. Wounding induces a quick and striking increase in intracellular calcium in the cells closer to the wound, which triggers a cascade of events that leads to the formation of the contractile cable and consequent wound closure. We showed that, besides this rise in cytosolic calcium, wounding also prompts an increase in mitochondrial calcium upon wounding. The uptake of calcium by mitochondria is known as an essential mechanism in controlling cytosolic calcium levels. Given the pleiotropic effects of calcium ions in the cell, its concentration needs to be tightly regulated in a spatial and temporal manner. Based on our results, we propose that Drp1 regulates the mitochondrial calcium buffering capacity, which then controls cytosolic calcium levels. Consistent with the described role of calcium in coordinating F-actin dynamics during wound healing, we also show that Drp1 mutants display significant defects in F-actin accumulation at the wound edge and in wound closure kinetics. Altogether, our results lead us to propose a model where mitochondrial fission is induced upon injury; this leads to a controlled increase in intracellular calcium, which then activates the main cytoskeleton changes needed to promote efficient wound healing. This work places Drp1 and mitochondrial fission as upstream players in the cascade leading to the main events of wound healing. As calcium and F-actin are crucial elements of the wound healing response across different types of epithelia, our work has relevant implications in the understanding of epithelial repair in other systems. Finally, our results also expand the knowledge about mitochondria biology and their relevance for different cellular processes.
RESUMO: Os epitélios formam uma barreira que protege o nosso corpo do ambiente externo. Uma lesão constitui um desafio a esta função de barreira e deve ser resolvida de forma eficiente para manter a integridade e função dos epitélios. A cicatrização de feridas varia no grau de complexidade depedendo do tipo de epitélio, mas envolve uma série de respostas conservadas. A ferida promove a libertação de moléculas que servem como sinais para o tecido circundante coordenar uma cascata de eventos, que inclui uma resposta imunitária e alterações coordenadas no citoesqueleto e adesões celulares, de forma a fechar a ferida e restaurar a integridade epitelial. Compreender os mecanismos moleculares envolvidos nestes diferentes passos é extremamente relevante do ponto de vista biológico e biomédico. Os tecidos embrionários têm uma capacidade notável de resolver lesões, fechando as feridas de forma rápida e sem deixar cicatriz. O conhecimento adquirido através destes modelos poderá ser útil para melhorar as terapêuticas atuais para complicações inerentes à cicatrização de feridas em humanos, como é o caso das feridas crónicas. A cicatrização de feridas no estádio embrionário envolve a formação de um cabo contrátil de actina e miosina na margem da ferida que coordena o movimento coletivo do tecido de forma a aproximar os limites da ferida e fechar a brecha. Este processo acontece em paralelo com migração celular e rearranjos na forma e posição das células, de forma a fechar a ferida sem o envolvimento de proliferação celular. As mitocôndrias são organelos cruciais para a sobrevivência das células. São organelos conhecidos principalmente pela sua capacidade de produção de energia, mas desempenham outras funções críticas nas células, tais como a regulação do cálcio e do estado redox, e da morte celular. As mitocôndrias são organelos dinâmicos, com a capacidade de mudar a sua forma, número e localização como forma de adaptação às necessidades celulares. Estes processos são denominados de dinâmica mitocondrial e possuem um papel importante no controlo das funções mitocondriais. A dinâmica mitocondrial inclui eventos de fusão e fissão que modulam a morfologia das mitocôndrias, processos de biogénese e mitofagia que regulam o número de mitocôndrias e o seu controlo de qualidade, e mecanismos de tráfego mitocondrial que controlam a localização subcelular das mitocôndrias em resposta às necessidades da célula. A disfunção na maquinaria molecular que controla a dinâmica mitocondrial está associada a várias patologias humanas, tais como cancro e doenças neurodegenerativas e metabólicas. Contudo, o papel das mitocôndrias e dinâmica mitocondrial na reparação de tecidos in vivo não foi até agora investigado. Neste trabalho tirámos partido de marcadores fluorescentes geneticamente codificados, imagiologia de alta resolução e técnicas de ablação avançadas para compreender a contribuição da dinâmica mitocondrial na reparação epitelial in vivo, usando a epiderme do embrião da mosca-da-fruta (Drosophila melanogaster) como modelo. Este estudo permitiu-nos identificar proteínas envolvidas na fissão, fusão e tráfego mitocondrial como novos reguladores da cicatrização de feridas. A observação do processo de fecho de ferida in vivo e em tempo real revelou que as proteínas Drp1 e Opa1, envolvidas na fissão e fusão mitocondrial, respetivamente, regulam o cálcio e o citoesqueleto de actina durante a cicatrização da ferida. Adicionalmente, descobrimos que a ferida promove alterações na morfologia mitocondrial que sugerem uma indução de fissão mitocondrial. A perda de função de Drp1 conduz a defeitos na dinâmica do cálcio citosólico e mitocondrial em resposta à ferida. Os iões de cálcio são importantes segundos-mensageiros em várias vias de sinalização e são reguladores fundamentais no processo de cicatrização de feridas. A ferida induz um aumento rápido e dramático no aumento dos níveis intracelulares de cálcio, que despoleta a cascata de eventos que culmina na formação do cabo de actina e miosina e consequente fecho da ferida. Neste trabalho mostrámos que, para além do aumento de cálcio no citosol, a ferida também induz um aumento no cálcio mitocondrial. Sabe-se que o influxo de cálcio para o interior das mitocôndrias é um mecanismo essencial para a regulação dos níveis de cálcio no citosol. Dado a variedade de funções desempenhadas pelo cálcio, a sua concentração celular deve ser regulada no tempo e no espaço. Com base nos nossos resultados, propomos que Drp1 regula a capacidade de captação de cálcio pelas mitocôndrias, o que por sua vez controla os níveis de cálcio no citosol. Em concordância com o papel descrito do cálcio na regulação do citoesqueleto de actina durante a cicatrização de feridas, mostrámos ainda que mutantes para Drp1 possuem defeitos significativos na acumulação de actina nas margens da ferida e na dinâmica de fecho da ferida. Em suma, os nossos resultados levam-nos a propor um modelo onde a fissão mitocondrial é induzida pela ferida, levando a um aumento controlado dos níveis intracelulares de cálcio, o que então regula as alterações no citoesqueleto necessárias para promover a cicatrização de forma eficiente. Este trabalho coloca a proteína Drp1 e a fissão mitocondrial no topo da cascata de sinalização que leva aos principais eventos na cicatrização de feridas. Dado que o cálcio e a actina são elementos cruciais na resposta à ferida em diferentes tipos de tecidos epiteliais, o nosso trabalho tem implicações relevantes na compreensão da reparação de tecidos noutros sistemas. Por fim, os nossos resultados aumentam o conhecimento da biologia mitocondrial e da sua relevância para diferentes processos celulares.
Topical name Mitochondria
Drosophila
Academic Dissertations
Index terms Tese de Doutoramento
Envelhecimento e Doenças Crónicas
NOVA Medical School
Universidade NOVA de Lisboa
2020
CDU 616 Online Resources Click here to access the eletronic resource http://hdl.handle.net/10362/102585
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Holdings
Item type Current location Call number url Status Date due Barcode
Documento Eletrónico Biblioteca NMS|FCM
online
RUN http://hdl.handle.net/10362/102585 Permanente 20210067

ABSTRACT: Epithelia form the barrier that protects our body against the external environment. An injury represents a challenge to barrier homeostasis and must be repaired efficiently to maintain epithelial integrity and function. Wound healing in different types of epithelia varies in complexity but encompasses a series of conserved responses. The wound triggers the release of molecules that signal to the surviving tissue, leading to a cascade of events that include an immune response, and coordinated changes in the cellular cytoskeleton and adhesion machineries to close the wound and restore epithelial integrity. Understanding the molecular mechanisms involved in these different steps is highly relevant from the biological and biomedical perspective. Embryonic tissues have a remarkable ability to deal with injury by closing the wounds in a quick and scarless manner. The lessons learned from this model system should be useful to improve the current therapeutics for wound healing complications in humans, such as chronic wounds. Embryonic wound healing relies on the formation of a contractile cable at the wound leading edge, formed by the actin and myosin cytoskeleton, that coordinates the collective tissue movement that brings the wound edges together and closes the gap. This process is coordinated with cell crawling, cellular rearrangements and shape changes, in order to close the wound without the involvement of cell proliferation. Mitochondria are pivotal organelles for cell survival. Known as the powerhouse of the cell due to their energy production capability, they also perform other critical cellular functions, such as the regulation of calcium and redox homeostasis and apoptosis. Mitochondria are dynamic organelles, being able to change their shape, number and localization to adapt to the cellular needs. These events are collectively termed mitochondrial dynamics and play an important role in modulating mitochondrial functions. Mitochondrial dynamics includes fusion and fission events, which modulate morphology; mitochondrial biogenesis and mitophagy, which regulate mitochondrial number and quality control; and mitochondrial trafficking, which controls the subcellular distribution of mitochondria in response to the cellular needs. Dysfunction in the molecular machinery that governs mitochondrial dynamics is associated with a plethora of human pathologies, such as cancer, and neurodegenerative and metabolic diseases. However, the role of mitochondria and mitochondrial dynamics in epithelial repair in vivo has so far not been investigated. In this work, we took advantage of genetically-encoded fluorescent markers, high-resolution imaging and advanced laser ablation techniques to understand the contribution of mitochondrial dynamics to epithelial repair in vivo, in the Drosophila embryonic epidermis. Using a genetic screen assay, we identified proteins involved in mitochondrial fission, fusion and trafficking as novel wound healing regulators. In vivo live imaging of the wound closure process revealed that Dynamin related protein 1 (Drp1) and Optic Atrophy 1 (Opa1) proteins, that are central players in mitochondrial fission and fusion, respectively, regulate calcium and actin cytoskeleton dynamics during wound healing. Moreover, we showed that wounding induces changes in mitochondrial morphology in the cells facing the wound, suggesting that the injury induces mitochondrial fission. We found that Drp1 loss of function leads to defects in both cytosolic and mitochondrial calcium dynamics upon wounding. Calcium ions are important second messengers in a myriad of signalling pathways and key players in the most important wound healing events. Wounding induces a quick and striking increase in intracellular calcium in the cells closer to the wound, which triggers a cascade of events that leads to the formation of the contractile cable and consequent wound closure. We showed that, besides this rise in cytosolic calcium, wounding also prompts an increase in mitochondrial calcium upon wounding. The uptake of calcium by mitochondria is known as an essential mechanism in controlling cytosolic calcium levels. Given the pleiotropic effects of calcium ions in the cell, its concentration needs to be tightly regulated in a spatial and temporal manner. Based on our results, we propose that Drp1 regulates the mitochondrial calcium buffering capacity, which then controls cytosolic calcium levels. Consistent with the described role of calcium in coordinating F-actin dynamics during wound healing, we also show that Drp1 mutants display significant defects in F-actin accumulation at the wound edge and in wound closure kinetics. Altogether, our results lead us to propose a model where mitochondrial fission is induced upon injury; this leads to a controlled increase in intracellular calcium, which then activates the main cytoskeleton changes needed to promote efficient wound healing. This work places Drp1 and mitochondrial fission as upstream players in the cascade leading to the main events of wound healing. As calcium and F-actin are crucial elements of the wound healing response across different types of epithelia, our work has relevant implications in the understanding of epithelial repair in other systems. Finally, our results also expand the knowledge about mitochondria biology and their relevance for different cellular processes.

RESUMO: Os epitélios formam uma barreira que protege o nosso corpo do ambiente externo. Uma lesão constitui um desafio a esta função de barreira e deve ser resolvida de forma eficiente para manter a integridade e função dos epitélios. A cicatrização de feridas varia no grau de complexidade depedendo do tipo de epitélio, mas envolve uma série de respostas conservadas. A ferida promove a libertação de moléculas que servem como sinais para o tecido circundante coordenar uma cascata de eventos, que inclui uma resposta imunitária e alterações coordenadas no citoesqueleto e adesões celulares, de forma a fechar a ferida e restaurar a integridade epitelial. Compreender os mecanismos moleculares envolvidos nestes diferentes passos é extremamente relevante do ponto de vista biológico e biomédico. Os tecidos embrionários têm uma capacidade notável de resolver lesões, fechando as feridas de forma rápida e sem deixar cicatriz. O conhecimento adquirido através destes modelos poderá ser útil para melhorar as terapêuticas atuais para complicações inerentes à cicatrização de feridas em humanos, como é o caso das feridas crónicas. A cicatrização de feridas no estádio embrionário envolve a formação de um cabo contrátil de actina e miosina na margem da ferida que coordena o movimento coletivo do tecido de forma a aproximar os limites da ferida e fechar a brecha. Este processo acontece em paralelo com migração celular e rearranjos na forma e posição das células, de forma a fechar a ferida sem o envolvimento de proliferação celular. As mitocôndrias são organelos cruciais para a sobrevivência das células. São organelos conhecidos principalmente pela sua capacidade de produção de energia, mas desempenham outras funções críticas nas células, tais como a regulação do cálcio e do estado redox, e da morte celular. As mitocôndrias são organelos dinâmicos, com a capacidade de mudar a sua forma, número e localização como forma de adaptação às necessidades celulares. Estes processos são denominados de dinâmica mitocondrial e possuem um papel importante no controlo das funções mitocondriais. A dinâmica mitocondrial inclui eventos de fusão e fissão que modulam a morfologia das mitocôndrias, processos de biogénese e mitofagia que regulam o número de mitocôndrias e o seu controlo de qualidade, e mecanismos de tráfego mitocondrial que controlam a localização subcelular das mitocôndrias em resposta às necessidades da célula. A disfunção na maquinaria molecular que controla a dinâmica mitocondrial está associada a várias patologias humanas, tais como cancro e doenças neurodegenerativas e metabólicas. Contudo, o papel das mitocôndrias e dinâmica mitocondrial na reparação de tecidos in vivo não foi até agora investigado. Neste trabalho tirámos partido de marcadores fluorescentes geneticamente codificados, imagiologia de alta resolução e técnicas de ablação avançadas para compreender a contribuição da dinâmica mitocondrial na reparação epitelial in vivo, usando a epiderme do embrião da mosca-da-fruta (Drosophila melanogaster) como modelo. Este estudo permitiu-nos identificar proteínas envolvidas na fissão, fusão e tráfego mitocondrial como novos reguladores da cicatrização de feridas. A observação do processo de fecho de ferida in vivo e em tempo real revelou que as proteínas Drp1 e Opa1, envolvidas na fissão e fusão mitocondrial, respetivamente, regulam o cálcio e o citoesqueleto de actina durante a cicatrização da ferida. Adicionalmente, descobrimos que a ferida promove alterações na morfologia mitocondrial que sugerem uma indução de fissão mitocondrial. A perda de função de Drp1 conduz a defeitos na dinâmica do cálcio citosólico e mitocondrial em resposta à ferida. Os iões de cálcio são importantes segundos-mensageiros em várias vias de sinalização e são reguladores fundamentais no processo de cicatrização de feridas. A ferida induz um aumento rápido e dramático no aumento dos níveis intracelulares de cálcio, que despoleta a cascata de eventos que culmina na formação do cabo de actina e miosina e consequente fecho da ferida. Neste trabalho mostrámos que, para além do aumento de cálcio no citosol, a ferida também induz um aumento no cálcio mitocondrial. Sabe-se que o influxo de cálcio para o interior das mitocôndrias é um mecanismo essencial para a regulação dos níveis de cálcio no citosol. Dado a variedade de funções desempenhadas pelo cálcio, a sua concentração celular deve ser regulada no tempo e no espaço. Com base nos nossos resultados, propomos que Drp1 regula a capacidade de captação de cálcio pelas mitocôndrias, o que por sua vez controla os níveis de cálcio no citosol. Em concordância com o papel descrito do cálcio na regulação do citoesqueleto de actina durante a cicatrização de feridas, mostrámos ainda que mutantes para Drp1 possuem defeitos significativos na acumulação de actina nas margens da ferida e na dinâmica de fecho da ferida. Em suma, os nossos resultados levam-nos a propor um modelo onde a fissão mitocondrial é induzida pela ferida, levando a um aumento controlado dos níveis intracelulares de cálcio, o que então regula as alterações no citoesqueleto necessárias para promover a cicatrização de forma eficiente. Este trabalho coloca a proteína Drp1 e a fissão mitocondrial no topo da cascata de sinalização que leva aos principais eventos na cicatrização de feridas. Dado que o cálcio e a actina são elementos cruciais na resposta à ferida em diferentes tipos de tecidos epiteliais, o nosso trabalho tem implicações relevantes na compreensão da reparação de tecidos noutros sistemas. Por fim, os nossos resultados aumentam o conhecimento da biologia mitocondrial e da sua relevância para diferentes processos celulares.

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