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Biomarcadores na pneumonia / Luís Miguel da Cruz Coelho ; orient. Pedro Póvoa

Main Author Coelho, Luís Miguel da Cruz Secondary Author Póvoa, Pedro Manuel Sarmento Rodrigues Publication Lisboa : Nova Medical School, 2020 Description 204 p. : il. Abstract ABSTRACT: Introduction: Male breast carcinoma (male BC) is an uncommon neoplasm with rising incidence, emerging in the last years as a multifactorial and distinct subtype of BC. It is frequently diagnosed in anatomic advanced stage disease and has no individualized strategies for diagnosis, therapeutics and follow-up. The existent ones are based in female BC. Our main objective was to identify biological factors with potential to innovate the clinical management of male BC. To achieve this aim, the thesis integrated three principal studies. In a first study, we collected a series of 196 male BC cases, evaluated clinicopathological parameters currently used as prognostic and predictive factors, as well as germline BRCA mutation (gBRCA) and DNA ploidy status, and analyzed their association with disease-free survival (DFS) and overall survival (OS). The central purpose was to obtain and to characterize a well-defined series of cases with detailed clinicopathological data for additional research. In the second study, we considered the relevance of altered homologous recombination repair (HRR) and explored the potential of aberrant promoter methylation of five HRR genes in male BC detection and/or monitorization, also because there is an increasing interest in understanding the molecular basis of sensitivity to PARP inhibitors (PARPi) in patients with deficient HRR and no gBRCA1/2 mutations. Finally, in the 3rd study, using immunohistochemistry (IHC), we aimed to identify IHC epithelial and stromal phenotypes with prognostic and/or predictive value and potential eligibility for application in the clinical management of male BC.Material and Methods: We profiled 196 patients (1970-2018; mean follow-up:171.3 months), using clinicopathological review and molecular assessment (gBRCA status, immunohistochemistry, in situ hybridization, DNA flow cytometry). Additionally, we used formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples from 128 male BC carcinomas, paired adjacent normal tissue and 19 gynecomastia cases, for the evaluation of aberrant promoter methylation of ATM, BRCA1, PALB2, RAD51B and XRCC3 by quantitative methylation-specific PCR. In addition, we selected 40 of the invasive male BC series with no neoadjuvant therapy, to evaluate IHC in Tissue Microarrays (TMAs) with Androgen Receptor (AR), Activating Transcription Factor 3 (ATF3), p16 and Cyclin D1, Fatty Acid Synthase (FASN), Fatty Acid Transport Protein 1 (FATP1), 1, 3, 4 and 6 integrins, Collagen I and Collagen IV. In the first and third evaluations, Pearson’s χ2 and Fisher’s exact tests of independence and a Cox proportional hazards regression model were employed for statistical analysis. Non-parametric tests were used in the second study to compare methylation levels between tumor and non-tumor samples and to seek for associations with clinicopathological variables. As gynecomastia is the most frequent benign condition in male breast, we used gynecomastia as comparative model in these two studies. Results: The median age of the patients was 66.5 years. The majority of cases were invasive carcinoma of no special type, histological grade 2 (G2), estrogen receptor  (ER) and progesterone receptor (PR) positive, ERBB2 negative, high Ki67, Luminal B-like and aneuploid. Thirteen of the 44 (29.5%) gBRCA evaluated patients had gBRCA2 mutations, significantly linked with family history, bilaterality, high Ki67, absence of PR and Luminal B-like. Bilaterality was associated with the occurrence of non-breast primary neoplasms (NBPT). The 5/10-year disease-free survival (DFS) rates of 145 patients (excluding M1 patients at diagnosis, patients with non-breast primary neoplasms and with in situ carcinomas) were 65.9% and 58.2% and overall survival (OS) rates were 77.5% and 59.2%, respectively. In univariate analysis, age at diagnosis ≥70 years and HER2-like carcinomas were significantly associated with low OS and G3 carcinomas were associated with short DFS. Also, in univariate analysis, pT 2+3 and pT4, pN1, anatomic stage II and III, high Ki67, Luminal B-like carcinomas and gBRCA2 mutations were significantly related with short DFS and low OS. In multivariate analysis,bilaterality and G3 carcinomas were significantly associated with short DFS as well as family history and Luminal B subtype with low OS. In addition, AS II and III were significantly associated with short DFS and low OS. In the second study, RAD51B and XRCC3 disclosed significant differences between tumor and gynecomastia (p<0.0001 and p=0.020, respectively). Assembled in a panel, the promoter methylation levels of these genes discriminated male BC from gynecomastia with 91.5% sensitivity, 89.5% specificity and 91.2% accuracy. No associations were found between epigenetic alterations and clinicopathological features. The IHC study showed that homogeneous and intense epithelial staining of p16, ATF3, 6 integrin, FASN and FATP1 was significantly intercorrelated, and significantly associated with high Ki67. All these biomarkers, with the exception of FASN, stained ibroblasts in a different proportion, and p16 also stained fibroblasts in malignant epithelial negative cases. Kaplan-Meier/log-rank tests showed significant associations of homogeneous phenotype of FASN with DFS and OS, of ATF3 with OS, as well as diffuse and intense stromal Collagen IV staining with DFS. No homogeneous epithelial pattern or intense Collagen IV stromal staining were identified in gynecomastia tissue. Conclusions: Male BC was commonly diagnosed in high anatomic stages and has low OS rates. The significant relation of gBRCA2 mutations with family history, bilaterality, Luminal B subtype, negative progesterone receptors, high Ki67 and worst prognosis, identifies a group of male BC deserving a particular clinical approach. In multivariate analysis, bilaterality and G3 carcinomas were significantly associated with short DFS and family history as well as Luminal B subtype with low OS. Moreover, AS II and III were significantly associated with short DFS and low OS. The quantitative promoter methylation of RAD51B and XRCC3, evaluated as a panel in tumoral tissue, constitutes a promising biomarker for detection and monitorization of male BC, and should be considered in clinical trials involving PARPi in men belonging to hereditary cancer families and with no detect gBRCA1/2 mutations. We highlight the value of the intratumoral homogeneity of malignant epithelial cells in biomarkers with distinct biological functions, of their interactions and their significant association with high proliferation. The prognostic relevance of homogeneous phenotype FASN and ATF3, as well as the diffuse and intense Collagen IV stromal staining may contribute to identify carcinomas of Luminal subtypes with worse outcome. These biomarkers are eligible for investigation as with potential to innovate the clinical management of male BC and,eventually, of Luminal subtypes female BC.
RESUMO: Introdução: O carcinoma da mama masculina é uma neoplasia pouco comum,mas com incidência crescente, que se tem destacado nos últimos anos como um subtipo de carcinoma da mama, multifatorial e com características próprias. É frequentemente diagnosticado em estádio avançado e não existem estratégias individualizadas para diagnóstico, terapêutica ou seguimento clínico, que se baseiam no carcinoma da mama feminina. O nosso objetivo major é contribuir para a caracterização desta neoplasia, pela identificação de fatores biológicos com potencial para inovar a abordagem clínica. Para conseguir este objetivo integrámos nesta tese, três artigos principais. No primeiro, selecionámos uma série de 196 casos de carcinoma da MM, avaliámos parâmetros clínico-patológicos utilizados na prática clínica como fatores prognósticos e preditivos, pesquisámos o status da mutação germinal BRCA (gBRCA) e a ploidia do ADN, identificámos a associação destes parâmetros com o intervalo livre de doença (ILD) e com a sobrevivência global (SG). O objetivo foi obter uma série de casos bem estruturados para estudo subsequente. No segundo estudo, considerámos a importância da recombinação homóloga na reparação do ADN e explorámos o potencial da metilação aberrante do promotor de 5 genes na deteção e/ ou monotorização do carcinoma da mama masculina, tanto mais porque há um interesse crescente na compreensão da base molecular da sensibilidade aos inibidores da PARP (PARPi) em doentes com deficiente reparação por recombinação homóloga sem mutações BRCA1/2. No terceiro estudo, o nosso propósito foi utilizar a imunohistoquímica (IHQ) em TMAs para avaliar padrões de biomarcadores epiteliais e do estroma com potencial valor prognóstico e/ou preditivo e passíveis de aplicação na prática clínica do carcinoma da mama masculina.Material e Métodos: No primeiro estudo, obtivemos o perfil de uma série de 196 pacientes (1970-2018; média de seguimento clínico: 171,3 meses), fizemos a revisão Introdução: O carcinoma da mama masculina é uma neoplasia pouco comum, mas com incidência crescente, que se tem destacado nos últimos anos como um subtipo de carcinoma da mama, multifatorial e com características próprias. É frequentemente diagnosticado em estádio avançado e não existem estratégias individualizadas para diagnóstico, terapêutica ou seguimento clínico, que se baseiam no carcinoma da mama feminina. O nosso objetivo major é contribuir para a caracterização desta neoplasia, pela identificação de fatores biológicos com potencial para inovar a abordagem clínica. Para conseguir este objetivo integrámos nesta tese, três artigos principais. No primeiro, selecionámos uma série de 196 casos de carcinoma da MM, avaliámos parâmetros clínico-patológicos utilizados na prática clínica como fatores prognósticos e preditivos, pesquisámos o status da mutação germinal BRCA (gBRCA) e a ploidia do ADN, identificámos a associação destes parâmetros com o intervalo livre de doença (ILD) e com a sobrevivência global (SG). O objetivo foi obter uma série de casos bem estruturados para estudo subsequente. No segundo estudo, considerámos a importância da recombinação homóloga na reparação do ADN e explorámos o potencial da metilação aberrante do promotor de 5 genes na deteção e/ ou monotorização do carcinoma da mama masculina, tanto mais porque há um interesse crescente na compreensão da base molecular da sensibilidade aos inibidores da PARP (PARPi) em doentes com deficiente reparação por recombinação homóloga sem mutações BRCA1/2. No terceiro estudo, o nosso propósito foi utilizar a imunohistoquímica (IHQ) em TMAs para avaliar padrões de biomarcadores epiteliais e do estroma com potencial valor prognóstico e/ou preditivo e passíveis de aplicação na prática clínica do carcinoma da mama masculina. Material e Métodos: No primeiro estudo, obtivemos o perfil de uma série de 196 pacientes (1970-2018; média de seguimento clínico: 171,3 meses), fizemos a revisão clínico-patológica e a avaliação de características moleculares (status da mutação gBRCA, IHQ, hibridização in situ, citometria de fluxo) e a análise estatística. No segundo estudo, avaliámos os níveis de metilação aberrante do promotor dos genes ATM, BRCA1, PALB2, RAD51B e XRCC3 por PCR quantitativo, em amostras de tecido fixado em formol e incluído em parafina de 128n carcinomas desta série, respetivo tecido normal adjacente e 19 casos de ginecomastia. No terceiro estudo, construímos vários TMAs com 40 deste clínico-patológica e a avaliação de características moleculares (status da mutação gBRCA, IHQ, hibridização in situ, citometria de fluxo) e a análise estatística. No segundo estudo, avaliámos os níveis de metilação aberrante do promotor dos genes ATM, BRCA1, PALB2,RAD51B e XRCC3 por PCR quantitativo, em amostras de tecido fixado em formol e incluído em parafina de 128n carcinomas desta série, respetivo tecido normal adjacente e 19 casos de ginecomastia. No terceiro estudo, construímos vários TMAs com 40 destes carcinomas invasivos sem terapêutica neoadjuvante, para avaliar o padrão da IHC com Receptores de Androgénios, Ativador do Fator de Transcrição 3 (ATF3), p16, Ciclina D1, Fator de Síntese de Ácidos Gordos (FASN), Proteína de Transporte de Ácidos Gordos 1 (FATP1), Integrinas 1, 3, 4 e  6, Colagénio I e Colagénio IV. Foram ainda utilizados 8 casos de ginecomastia como modelo comparativo. No primeiro e terceiro estudo, utilizámos os testes de Pearson χ2 e Fisher e o modelo de Cox para análise estatística. No segundo estudo utilizámos testes não paramétricos para comparar os níveis de metilação entre amostras tumorais e não tumorais e para procurar associações com variáveis clínico-patológicas. Como a ginecomastia é a condição benigna mais frequente na mama masculina, utilizámos a ginecomastia como modelo comparativo nos dois últimos estudos. Resultados: A média de idade dos doentes foi de 66,5 anos e observámos um predomínio de carcinomas invasivos sem tipo especial, grau histológico 2 (G2), com receptores de estrogénios  (RE) e receptores de progesterona (RP) positivos, com ERBB2 negativo, com Ki67 alto, de subtipo Luminal B-like e aneuplóides. Treze dos 44 (29,5%) pacientes avaliados para risco genético apresentaram mutações germinais no BRCA2, que estavam significativamente relacionadas com história familiar (HF),bilateralidade, valores elevados de Ki67, ausência de RP e subtipo Luminal B-like. A bilateralidade associou-se à ocorrência de neoplasias primárias não mamárias. As taxas de ILD em 5/10 anos de 145 doentes (excluindo os doentes M1, os doentes com neoplasias primárias não mamárias e os doentes com carcinomas in situ) foram de 65,9% e 58,2% e as taxas de SG foram de 77,5% e 59,2%, respetivamente. Em análise univariada, a idade ao diagnóstico ≥70 anos e os carcinomas ERBB2 positivos associaram-se significativamente com menor SG e os carcinomas G3 associaram-se a menor ILD. Ainda, em análise univariada, os carcinomas pT 2+3 e pT4, pN1, estádios anatómicos II e III, Ki67 alto, carcinomas Luminal B-like e as mutações gBRCA2 associaram-se significativamente a menor ILD e menor SG. Em análise multivariada, a bilateralidade e os carcinomas G3 associaram-se significativamente a menor ILD e a história familiar assim como o subtipo Luminal B-like a menor SG. Ainda, os estádios anatómicos II e III associaram-se a menor ILD e menor SG. No segundo estudo, apenas a metilação dos promotores dos genes RAD51B e o XRCC3 revelou diferenças significativas entre tumor e ginecomastia (p<0,0001 e p=0,020, respetivamente). A metilação simultânea dos promotores dos genes RAD51B e XRCC3 discriminou o carcinoma da mama masculina da ginecomastia, com 91,5% de sensibilidade, 89,5% de especificidade e 91,2% de acuidade. Além disso, os níveis de metilação do promotor destes genes foram menores nas amostras dos tecidos não tumorais, em comparação com as amostras dos respetivos tumores. Não foram encontradas associações entre alterações epigenéticas e características clínico-patológicas. O estudo com IHC mostrou que a positividade homogénea das células epiteliais malignas em relação com os biomarcadores p16, ATF3, integrina 6, FASN e FATP1 estava significativamente inter-relacionada e significativamente associada com Ki67 alto. Todos estes biomarcadores, com exceção do FASN, mostraram positividade nos fibroblastos do estroma tumoral em diferentes percentagens e o p16 também marcou fibroblastos nos casos p16 negativos nas células epiteliais. Os testes de Kaplan-Meier/ log-rank mostraram associações significativas do fenótipo homogéneo do FASN com o ILD e com a SG, do ATF3 com a SG, assim como a marcação difusa e intensa do Colagénio IV com o ILD. Não identificámos nenhum padrão homogéneo das células epiteliais nem marcação intensa com Colagénio IV no tecido da ginecomastia. Conclusões: O carcinoma da mama masculina é comumente diagnosticado em estádios avançados e apresenta baixa sobrevivência global. A relação da mutação gBRCA com a história familiar, bilateralidade, subtipo Luminal B, carcinomas progesterona negativos, Ki67 alto e com pior prognóstico, identifica um subgrupo de carcinoma da mama masculina a merecer avaliação clínica específica. Em análise multivariada, a bilateralidade e os carcinomas G3 associaram-se de forma significativa a menor ILD, assim como a história familiar e o subtipo Luminal B a menor SG. Os estádios anatómicos II e III associaram-se significativamente a menor ILD e menor SG. A quantificação dos níveis de metilação dos promotores dos genes RAD51B e XRCC3, avaliada em conjunto no tecido tumoral, constituiu um biomarcador de carcinoma da mama masculina, a considerar particularmente em ensaios clínicos que envolvam terapêutica com inibidores da PARP em homens pertencentes a famílias com cancro hereditário e sem mutações germinais BRCA1/2. Evidenciámos o valor do padrão homogéneo das células epiteliais malignas em biomarcadores com funções biológicas distintas, a sua inter-relação e a associação com o aumento da proliferação. O significado prognóstico do padrão homogéneo do FASN e ATF3, assim com da marcação intensa do estroma tumoral com Colagénio IV podem contribuir para identificar carcinomas Luminal-like com pior prognóstico e estes biomarcadores são elegíveis para investigação pelo potencial de poder inovar a terapêutica do carcinoma da mama masculina e, eventualmente, do carcinoma Luminal-like da mama feminina
Topical name Breast Neoplasms, Male
Biomarkers
DNA Repair
Gynecomastia
Academic Dissertation
Portugal
Index terms Tese de Doutoramento
Medicina Especialidade Investigação Clínica
NOVA Medical School
Universidade NOVA de Lisboa
2020
CDU 616 Online Resources Click here to access the eletronic resource http://hdl.handle.net/10362/108675
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RUN http://hdl.handle.net/10362/108675 Permanente 20210071

ABSTRACT: Introduction: Male breast carcinoma (male BC) is an uncommon neoplasm with rising incidence, emerging in the last years as a multifactorial and distinct subtype of BC.
It is frequently diagnosed in anatomic advanced stage disease and has no individualized strategies for diagnosis, therapeutics and follow-up. The existent ones are based in female
BC. Our main objective was to identify biological factors with potential to innovate the clinical management of male BC. To achieve this aim, the thesis integrated three principal
studies. In a first study, we collected a series of 196 male BC cases, evaluated clinicopathological parameters currently used as prognostic and predictive factors, as well as germline BRCA mutation (gBRCA) and DNA ploidy status, and analyzed their
association with disease-free survival (DFS) and overall survival (OS). The central purpose was to obtain and to characterize a well-defined series of cases with detailed clinicopathological data for additional research. In the second study, we considered the
relevance of altered homologous recombination repair (HRR) and explored the potential of aberrant promoter methylation of five HRR genes in male BC detection and/or monitorization, also because there is an increasing interest in understanding the molecular basis of sensitivity to PARP inhibitors (PARPi) in patients with deficient HRR and no gBRCA1/2 mutations. Finally, in the 3rd study, using immunohistochemistry (IHC), we aimed to identify IHC epithelial and stromal phenotypes with prognostic and/or predictive value and potential eligibility for application in the clinical management of male BC.Material and Methods: We profiled 196 patients (1970-2018; mean follow-up:171.3 months), using clinicopathological review and molecular assessment (gBRCA status, immunohistochemistry, in situ hybridization, DNA flow cytometry). Additionally, we used formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples from 128 male BC carcinomas, paired adjacent normal tissue and 19 gynecomastia cases, for the evaluation of aberrant promoter methylation of ATM, BRCA1, PALB2, RAD51B and XRCC3 by quantitative methylation-specific PCR. In addition, we selected 40 of the invasive male
BC series with no neoadjuvant therapy, to evaluate IHC in Tissue Microarrays (TMAs) with Androgen Receptor (AR), Activating Transcription Factor 3 (ATF3), p16 and Cyclin D1, Fatty Acid Synthase (FASN), Fatty Acid Transport Protein 1 (FATP1), 1, 3, 4 and 6 integrins, Collagen I and Collagen IV. In the first and third evaluations, Pearson’s χ2 and Fisher’s exact tests of independence and a Cox proportional hazards regression
model were employed for statistical analysis. Non-parametric tests were used in the second study to compare methylation levels between tumor and non-tumor samples and to seek for associations with clinicopathological variables. As gynecomastia is the most frequent benign condition in male breast, we used gynecomastia as comparative model in these two studies.
Results: The median age of the patients was 66.5 years. The majority of cases were invasive carcinoma of no special type, histological grade 2 (G2), estrogen receptor  (ER) and progesterone receptor (PR) positive, ERBB2 negative, high Ki67, Luminal B-like and aneuploid. Thirteen of the 44 (29.5%) gBRCA evaluated patients had gBRCA2 mutations, significantly linked with family history, bilaterality, high Ki67, absence of PR
and Luminal B-like. Bilaterality was associated with the occurrence of non-breast primary neoplasms (NBPT). The 5/10-year disease-free survival (DFS) rates of 145 patients (excluding M1 patients at diagnosis, patients with non-breast primary neoplasms and with in situ carcinomas) were 65.9% and 58.2% and overall survival (OS) rates were 77.5% and 59.2%, respectively. In univariate analysis, age at diagnosis ≥70 years and HER2-like carcinomas were significantly associated with low OS and G3 carcinomas were associated with short DFS. Also, in univariate analysis, pT 2+3 and pT4, pN1, anatomic stage II and III, high Ki67, Luminal B-like carcinomas and gBRCA2 mutations
were significantly related with short DFS and low OS. In multivariate analysis,bilaterality and G3 carcinomas were significantly associated with short DFS as well as family history and Luminal B subtype with low OS. In addition, AS II and III were significantly associated with short DFS and low OS. In the second study, RAD51B and XRCC3 disclosed significant differences between tumor and gynecomastia (p<0.0001 and
p=0.020, respectively). Assembled in a panel, the promoter methylation levels of these genes discriminated male BC from gynecomastia with 91.5% sensitivity, 89.5% specificity and 91.2% accuracy. No associations were found between epigenetic
alterations and clinicopathological features. The IHC study showed that homogeneous and intense epithelial staining of p16, ATF3, 6 integrin, FASN and FATP1 was significantly intercorrelated, and significantly associated with high Ki67. All these biomarkers, with the exception of FASN, stained ibroblasts in a different proportion, and p16 also stained fibroblasts in malignant epithelial negative cases. Kaplan-Meier/log-rank tests showed significant associations of homogeneous phenotype of FASN with DFS and OS, of ATF3 with OS, as well as diffuse and intense stromal Collagen IV staining with DFS. No homogeneous epithelial pattern or intense Collagen IV stromal staining were
identified in gynecomastia tissue. Conclusions: Male BC was commonly diagnosed in high anatomic stages and has low OS rates. The significant relation of gBRCA2 mutations with family history, bilaterality, Luminal B subtype, negative progesterone receptors, high Ki67 and worst prognosis, identifies a group of male BC deserving a particular clinical approach. In
multivariate analysis, bilaterality and G3 carcinomas were significantly associated with short DFS and family history as well as Luminal B subtype with low OS. Moreover, AS II and III were significantly associated with short DFS and low OS. The quantitative promoter methylation of RAD51B and XRCC3, evaluated as a panel in tumoral tissue, constitutes a promising biomarker for detection and monitorization of male BC, and
should be considered in clinical trials involving PARPi in men belonging to hereditary cancer families and with no detect gBRCA1/2 mutations. We highlight the value of the
intratumoral homogeneity of malignant epithelial cells in biomarkers with distinct biological functions, of their interactions and their significant association with high proliferation. The prognostic relevance of homogeneous phenotype FASN and ATF3, as well as the diffuse and intense Collagen IV stromal staining may contribute to identify carcinomas of Luminal subtypes with worse outcome. These biomarkers are eligible for
investigation as with potential to innovate the clinical management of male BC and,eventually, of Luminal subtypes female BC.

RESUMO: Introdução: O carcinoma da mama masculina é uma neoplasia pouco comum,mas com incidência crescente, que se tem destacado nos últimos anos como um subtipo de carcinoma da mama, multifatorial e com características próprias. É frequentemente diagnosticado em estádio avançado e não existem estratégias individualizadas para diagnóstico, terapêutica ou seguimento clínico, que se baseiam no carcinoma da mama feminina. O nosso objetivo major é contribuir para a caracterização desta neoplasia, pela identificação de fatores biológicos com potencial para inovar a abordagem clínica. Para
conseguir este objetivo integrámos nesta tese, três artigos principais. No primeiro, selecionámos uma série de 196 casos de carcinoma da MM, avaliámos parâmetros clínico-patológicos utilizados na prática clínica como fatores prognósticos e preditivos, pesquisámos o status da mutação germinal BRCA (gBRCA) e a ploidia do ADN, identificámos a associação destes parâmetros com o intervalo livre de doença (ILD) e
com a sobrevivência global (SG). O objetivo foi obter uma série de casos bem
estruturados para estudo subsequente. No segundo estudo, considerámos a importância da recombinação homóloga na reparação do ADN e explorámos o potencial da metilação
aberrante do promotor de 5 genes na deteção e/ ou monotorização do carcinoma da mama masculina, tanto mais porque há um interesse crescente na compreensão da base
molecular da sensibilidade aos inibidores da PARP (PARPi) em doentes com deficiente reparação por recombinação homóloga sem mutações BRCA1/2. No terceiro estudo, o nosso propósito foi utilizar a imunohistoquímica (IHQ) em TMAs para avaliar padrões de biomarcadores epiteliais e do estroma com potencial valor prognóstico e/ou preditivo e passíveis de aplicação na prática clínica do carcinoma da mama masculina.Material e Métodos: No primeiro estudo, obtivemos o perfil de uma série de 196 pacientes (1970-2018; média de seguimento clínico: 171,3 meses), fizemos a revisão Introdução: O carcinoma da mama masculina é uma neoplasia pouco comum, mas com incidência crescente, que se tem destacado nos últimos anos como um subtipo de carcinoma da mama, multifatorial e com características próprias. É frequentemente diagnosticado em estádio avançado e não existem estratégias individualizadas para diagnóstico, terapêutica ou seguimento clínico, que se baseiam no carcinoma da mama feminina. O nosso objetivo major é contribuir para a caracterização desta neoplasia, pela
identificação de fatores biológicos com potencial para inovar a abordagem clínica. Para conseguir este objetivo integrámos nesta tese, três artigos principais. No primeiro,
selecionámos uma série de 196 casos de carcinoma da MM, avaliámos parâmetros clínico-patológicos utilizados na prática clínica como fatores prognósticos e preditivos, pesquisámos o status da mutação germinal BRCA (gBRCA) e a ploidia do ADN,
identificámos a associação destes parâmetros com o intervalo livre de doença (ILD) e com a sobrevivência global (SG). O objetivo foi obter uma série de casos bem estruturados para estudo subsequente. No segundo estudo, considerámos a importância da recombinação homóloga na reparação do ADN e explorámos o potencial da metilação aberrante do promotor de 5 genes na deteção e/ ou monotorização do carcinoma da mama
masculina, tanto mais porque há um interesse crescente na compreensão da base molecular da sensibilidade aos inibidores da PARP (PARPi) em doentes com deficiente reparação por recombinação homóloga sem mutações BRCA1/2. No terceiro estudo, o nosso propósito foi utilizar a imunohistoquímica (IHQ) em TMAs para avaliar padrões de biomarcadores epiteliais e do estroma com potencial valor prognóstico e/ou preditivo
e passíveis de aplicação na prática clínica do carcinoma da mama masculina. Material e Métodos: No primeiro estudo, obtivemos o perfil de uma série de 196 pacientes (1970-2018; média de seguimento clínico: 171,3 meses), fizemos a revisão
clínico-patológica e a avaliação de características moleculares (status da mutação gBRCA, IHQ, hibridização in situ, citometria de fluxo) e a análise estatística. No segundo estudo,
avaliámos os níveis de metilação aberrante do promotor dos genes ATM, BRCA1, PALB2, RAD51B e XRCC3 por PCR quantitativo, em amostras de tecido fixado em formol e
incluído em parafina de 128n carcinomas desta série, respetivo tecido normal adjacente e 19 casos de ginecomastia. No terceiro estudo, construímos vários TMAs com 40 deste clínico-patológica e a avaliação de características moleculares (status da mutação gBRCA, IHQ, hibridização in situ, citometria de fluxo) e a análise estatística. No segundo estudo,
avaliámos os níveis de metilação aberrante do promotor dos genes ATM, BRCA1, PALB2,RAD51B e XRCC3 por PCR quantitativo, em amostras de tecido fixado em formol e
incluído em parafina de 128n carcinomas desta série, respetivo tecido normal adjacente e 19 casos de ginecomastia. No terceiro estudo, construímos vários TMAs com 40 destes carcinomas invasivos sem terapêutica neoadjuvante, para avaliar o padrão da IHC com Receptores de Androgénios, Ativador do Fator de Transcrição 3 (ATF3), p16, Ciclina D1, Fator de Síntese de Ácidos Gordos (FASN), Proteína de Transporte de Ácidos Gordos 1 (FATP1), Integrinas 1, 3, 4 e  6, Colagénio I e Colagénio IV. Foram ainda utilizados 8 casos de ginecomastia como modelo comparativo. No primeiro e terceiro estudo, utilizámos os testes de Pearson χ2 e Fisher e o modelo de Cox para análise estatística. No segundo estudo utilizámos testes não paramétricos para comparar os níveis de metilação entre amostras tumorais e não tumorais e para procurar associações com variáveis clínico-patológicas. Como a ginecomastia é a condição benigna mais frequente na mama masculina, utilizámos a ginecomastia como modelo comparativo nos dois
últimos estudos.
Resultados: A média de idade dos doentes foi de 66,5 anos e observámos um predomínio de carcinomas invasivos sem tipo especial, grau histológico 2 (G2), com receptores de estrogénios  (RE) e receptores de progesterona (RP) positivos, com
ERBB2 negativo, com Ki67 alto, de subtipo Luminal B-like e aneuplóides. Treze dos 44 (29,5%) pacientes avaliados para risco genético apresentaram mutações germinais no
BRCA2, que estavam significativamente relacionadas com história familiar (HF),bilateralidade, valores elevados de Ki67, ausência de RP e subtipo Luminal B-like. A bilateralidade associou-se à ocorrência de neoplasias primárias não mamárias. As taxas de ILD em 5/10 anos de 145 doentes (excluindo os doentes M1, os doentes com neoplasias primárias não mamárias e os doentes com carcinomas in situ) foram de 65,9% e 58,2% e as taxas de SG foram de 77,5% e 59,2%, respetivamente. Em análise univariada, a idade ao diagnóstico ≥70 anos e os carcinomas ERBB2 positivos associaram-se significativamente com menor SG e os carcinomas G3 associaram-se a menor ILD. Ainda, em análise univariada, os carcinomas pT 2+3 e pT4, pN1, estádios anatómicos II e III, Ki67 alto, carcinomas Luminal B-like e as mutações gBRCA2
associaram-se significativamente a menor ILD e menor SG. Em análise multivariada, a bilateralidade e os carcinomas G3 associaram-se significativamente a menor ILD e a
história familiar assim como o subtipo Luminal B-like a menor SG. Ainda, os estádios anatómicos II e III associaram-se a menor ILD e menor SG. No segundo estudo, apenas
a metilação dos promotores dos genes RAD51B e o XRCC3 revelou diferenças significativas entre tumor e ginecomastia (p<0,0001 e p=0,020, respetivamente). A metilação simultânea dos promotores dos genes RAD51B e XRCC3 discriminou o
carcinoma da mama masculina da ginecomastia, com 91,5% de sensibilidade, 89,5% de especificidade e 91,2% de acuidade. Além disso, os níveis de metilação do promotor destes genes foram menores nas amostras dos tecidos não tumorais, em comparação com as amostras dos respetivos tumores. Não foram encontradas associações entre alterações epigenéticas e características clínico-patológicas. O estudo com IHC mostrou que a positividade homogénea das células epiteliais malignas em relação com os biomarcadores p16, ATF3, integrina 6, FASN e FATP1 estava significativamente inter-relacionada e
significativamente associada com Ki67 alto. Todos estes biomarcadores, com exceção do FASN, mostraram positividade nos fibroblastos do estroma tumoral em diferentes
percentagens e o p16 também marcou fibroblastos nos casos p16 negativos nas células epiteliais. Os testes de Kaplan-Meier/ log-rank mostraram associações significativas do fenótipo homogéneo do FASN com o ILD e com a SG, do ATF3 com a SG, assim como a marcação difusa e intensa do Colagénio IV com o ILD. Não identificámos nenhum padrão homogéneo das células epiteliais nem marcação intensa com Colagénio IV no
tecido da ginecomastia.
Conclusões: O carcinoma da mama masculina é comumente diagnosticado em estádios avançados e apresenta baixa sobrevivência global. A relação da mutação gBRCA
com a história familiar, bilateralidade, subtipo Luminal B, carcinomas progesterona negativos, Ki67 alto e com pior prognóstico, identifica um subgrupo de carcinoma da
mama masculina a merecer avaliação clínica específica. Em análise multivariada, a bilateralidade e os carcinomas G3 associaram-se de forma significativa a menor ILD, assim como a história familiar e o subtipo Luminal B a menor SG. Os estádios anatómicos II e III associaram-se significativamente a menor ILD e menor SG. A quantificação dos níveis de metilação dos promotores dos genes RAD51B e XRCC3, avaliada em conjunto
no tecido tumoral, constituiu um biomarcador de carcinoma da mama masculina, a considerar particularmente em ensaios clínicos que envolvam terapêutica com inibidores da PARP em homens pertencentes a famílias com cancro hereditário e sem mutações germinais BRCA1/2. Evidenciámos o valor do padrão homogéneo das células epiteliais malignas em biomarcadores com funções biológicas distintas, a sua inter-relação e a
associação com o aumento da proliferação. O significado prognóstico do padrão homogéneo do FASN e ATF3, assim com da marcação intensa do estroma tumoral com Colagénio IV podem contribuir para identificar carcinomas Luminal-like com pior prognóstico e estes biomarcadores são elegíveis para investigação pelo potencial de poder inovar a terapêutica do carcinoma da mama masculina e, eventualmente, do carcinoma
Luminal-like da mama feminina

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