RESUMO: Nas últimas décadas a prevalência mundial de doenças metabólicas como a obesidade e a diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) tem aumentado exponencialmente, sendo atualmente uma séria preocupação de saúde, social e económica. Este aumento é paralelo ao aumento do sedentarismo e dos maus hábitos alimentares. De facto, a industrialização e a urbanização levaram ao aumento do consumo de alimentos com alto teor de hidratos de carbono e lípidos. A dieta, juntamente com a predisposição genética, são os principais causadores de desregulação metabólica, que acaba por levar ao aparecimento de complicações metabólicas em vários órgãos, como é o caso do fígado, músculo, tecido adiposo e testículo. O fígado tem um papel fundamental para a regulação da homeostase da glicose. No estado pósprandial, o fígado converte a glicose circulante em glicogénio. Por outro lado, no estado de jejum, a glicose é produzida a partir do glicogénio armazenado para manter os níveis de glicose em circulação dentro dos limites normais. De facto, a homeostase sistémica da glicose e da insulina é fortemente regulada por uma rede neuronal e hormonal. A insulina tem um papel central no controlo do metabolismo hepático, estimulando a glicólise e a lipogénese, enquanto suprime a produção endógena de glicose e de corpos cetónicos. Qualquer desequilíbrio no metabolismo energético do fígado pode levar a desregulações no metabolismo da glicose e da insulina e resistência à insulina, levando ao aparecimento de esteatose hepática não alcoólica (NAFLD) e T2DM. Sabe-se ainda que a T2DM e a disglicémia afetam vários sistemas, como o sistema reprodutor masculino. De facto, há uma maior prevalência de subfertilidade/infertilidade em indivíduos com diabetes. Para além disso, a glicose, a insulina e os lípidos têm um papel fundamental no controlo do metabolismo testicular. Efetivamente, as células de Sertoli dependem da glicose em circulação para produzir lactato, o substrato energético usado pelas células germinativas em desenvolvimento. Assim, o metabolismo das células testiculares é crucial para a ocorrência normal de espermatogénese e qualquer desregulação pode levar à diminuição da fertilidade. O objetivo geral deste trabalho foi o de contribuir para o entendimento da regulação homeostática do metabolismo da insulina, glicose e lípidos em estados metabólicos alterados, como obesidade e resistência à insulina. Primeiramente, avaliámos o metaboloma do fígado, músculo e tecido adiposo castanho no contexto de uma alimentação com alto teor de gordura ou frutose durante 12 semanas, abrangendo a fase equivalente à puberdade e à idade adulta. Os nossos resultados mostram que uma dieta rica em gordura durante 12 semanas causou aumento do peso, intolerância à glicose e resistência à insulina, enquanto a dieta rica em frutose durante o mesmo período de tempo levou à diminuição do peso corporal e não causou alterações na tolerância à glicose. Embora as dietas tenham efeitos distintos no ganho de peso corporal e tolerância à glicose, ambas causaram alterações significativas no metaboloma dos tecidos. No entanto, a dieta rica em gordura afetou de modo mais pronunciado o metaboloma do fígado e do músculo, enquanto a dieta rica em frutose afectou mais o metaboloma do tecido adiposo castanho. Além disso, ambas as dietas levaram a uma diminuição significativa na expressão de PON1. Tendo isso em conta, avaliámos o impacto da deleção de Pon1 nas consequências metabólicas da ingestão de uma dieta normal, dieta rica em gordura ou dieta rica em frutose. Neste estudo, a deleção de Pon1 levou ao aumento da intolerância à glicose em murganhos alimentados com dieta normal ou com uma dieta rica em gordura. Além disso, a ausência de PON1 levou ao aumento do péptido-C sem alterações nos níveis de insulina em todas as dietas, o que aponta para uma diminuição da clearance da insulina ou diminuição da excreção do péptido-C. Em termos de deposição lipídica no fígado, não foram encontradas diferenças por conta da deleção de Pon1, independentemente da dieta. Considerando os resultados anteriores, foi realizada uma análise de clusters em indíviduos normoglicémicos, com pré-diabetes ou T2DM para verificar se a atividade paraoxonase da PON1 (POase) e os níveis de apolipoproteína J poderiam melhorar o diagnóstico de dismetabolismo, ajudando a refinar e desvendar clusters com significado fisiopatológico distinto. Esta análise de clusters identificou quatro grupos. Um deles agrupou os indivíduos jovens e aparentemente saudáveis e, portanto, sem disglicémia nem dislipidémia e com alta POase. Outros indivíduos foram agrupados num grupo maioritariamente caracterizado por disglicémia, hiperinsulinémia e dislipidémia. Os restantes grupos apresentaram perfis intermédios de insulina e glicose em comparação com os dois primeiros grupos. No entanto, estes grupos apenas se distinguiam entre si pela POase. Sendo assim, a nossa hipótese é de que esses indivíduos com menor atividade da POase mas sem disglicémia significativa, tenham uma de duas condições: i) polimorfismos de Pon1 que resultam em baixa atividade POase e / ou ii) doença renal, resultando em disfunção do colesterol HDL, representada por baixa atividade de POase, sendo que esta última vai de encontro aos resultados obtidos no modelo animal com a deleção de Pon1. Embora se saiba que a desregulação da insulina e da glicose afetam a função reprodutiva masculina, os mecanismos exatos permanecem amplamente desconhecidos. Assim, avaliámos o impacto da hiperinsulinémia na função reprodutiva masculina. Para isso, usamos um modelo animal com deleção do gene que codifica para a enzima degradadora da insulina (IDE), levando a que os animais desenvolvam hiperinsulinémia. Os nossos resultados mostram que murganhos sem IDE apresentam uma morfologia testicular comprometida. Para além disso, estes animais também apresentam uma redução na qualidade espermática, nomeadamente da viabilidade e alterações na morfologia dos espermatozoides. Assim, este estudo mostra que a IDE desempenha um papel importante na determinação do potencial reprodutivo masculino. Em conclusão, este trabalho demonstrou que dietas ricas em gorduras e em frutose têm um impacto diferente, não apenas homeostase da glicose e da insulina, mas também nos tecidos sensíveis à insulina. Para além disso, os níveis hepáticos de PON1 foram afetados por essas dietas. Usando um modelo animal geneticamente modificado, foi demonstrado que a PON1 desempenha um papel na homeostase sistémica da glicose, sem afetar o ganho de peso. Após uma análise de clusters utilizando a atividade da POase, juntamente com o perfil lipídico e a função renal para informar a análise, verificou-se que a atividade da POase pode ser um valioso co-biomarcador para refinar perfis dismetabólicos com um significado fisiopatológico possivelmente distinto. Por fim, a IDE, por ter um papel na homeostase da insulina, contribui para a regulação da função reprodutiva masculina.Agrupados, os estudos que compõem esta dissertação demonstram que a PON1 e a IDE desempenham um papel na patogénese das co-morbilidades associadas à obesidade à pré-diabetes.

ABSTRACT: In the last decades the worldwide prevalence of metabolic diseases, as obesity and type 2 diabetes mellitus (T2DM), has exponentially increase posing as a serious health, social and economic concern. This increase parallels the increase of sedentarism and overnutrition. In fact, industrialization and urbanization led to the increased consumption of foods with high-carbohydrate and fat content. These, along with genetic predisposition, are the foremost contributors to metabolic dysregulation, namely hyperglycemia, dyslipidemia, and insulin resistance (IR), which ultimately lead to the onset of metabolic complications in several organs, such as the liver, muscle, adipose tissue and testes. The liver has a key role for the regulation of whole-body glucose homeostasis. In the fed state, liver uptakes and converts circulating glucose into glycogen. On the other hand, in the fasted state, glucose is produced in from stored glycogen to maintain circulating glucose levels within normal ranges. Indeed, both glucose and insulin whole-body homeostasis are tightly regulated by a neuronal and hormonal network. Insulin has a pivotal role in controlling hepatic metabolism, by stimulating glycolysis and lipogenesis while suppressing endogenous glucose production and ketogenesis. Any imbalance in the liver energy metabolism is a major contributor to overall glucose and insulin dysmetabolism, insulin resistance, and ectopic lipid accumulation ultimately leading to the onset of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and T2DM. T2DM and dysglycemia are known to affect several systems, as is the case of male reproductive system. Indeed, there is a higher prevalence of subfertility/infertility in individuals with diabetes. In fact, glucose, insulin and lipids have a key role in controlling the testicular metabolism. Moreover, Sertoli cells depend on circulating glucose to produce lactate, the energetic substrate used by developing germ cells. Thus, the metabolism of testicular cells is crucial for the normal occurrence of spermatogenesis and any dysregulation may lead to decreased fertility. The overall goal of this research work was to contribute to the understanding of the homeostatic regulation of insulin, glucose and lipid metabolism in altered metabolic states such as obesity and IR. Firstly, we assessed the metabolome of liver, muscle and brown adipose tissue in the context of highfat or high-fructose feeding for 12 weeks, covering the phase equivalent to puberty and adulthood. Our results demonstrate that a 12-week high-fat diet caused increased weight gain, glucose intolerance and insulin resistance, whereas high-fructose led to decreased body weight and did not lead to alterations in glucose tolerance. Although the diets had distinct effects on body weight gain and glucose tolerance, both led to significant alterations in the tissue’s metabolome. However, highfat diet affected more the metabolome of liver and muscle, while high-fructose diet seemed to affect more the brown adipose tissue. Moreover, both high-fat and high-fructose diet caused a significant decrease in the hepatic protein levels of PON1. Thus, the impact of whole-body Pon1 deletion upon the intake of normal chow, high-fat or high-fructose diets was evaluated. In this study, Pon1 deletion led to increased glucose intolerance in mice fed with normal chow diet or high-fat diet. Moreover, the absence of PON1 led to increased C-peptide levels with no changes in insulin levels of the diet, which points towards either decreased insulin clearance or impaired C-peptide excretion. In terms of ectopic lipid deposition, no differences where found upon Pon1 deletion regardless of the diet. Considering the previous results, a cluster analysis was performed in individuals with normoglycemia, prediabetes or T2DM, to evaluate whether PON1 paraoxonase (POase) activity and apolipoprotein J levels could improve the diagnosis of dysmetabolism, helping to refine and unveil clusters with distinct pathophysiological significance. In fact, the cluster analysis identified four clusters. One with the considered healthy and young individuals, and thus without dysglycemia, dyslipidemia and with high POase. Other cluster grouped individuals with dysglycemia, hyperinsulinemia, and dyslipidemia. The other two clusters presented intermediate insulin and glucose profiles compared with the first two clusters. However, these two groups were distinct in relation to POase activity. We hypothesize that these individuals with lower POase activity but without significant dysglycemia have one of two conditions: i) PON1 polymorphisms that result in low POase activity and/or ii) kidney disease, resulting in high-density lipoprotein cholesterol dysfunction that is represented by low POase activity. This last hypothesis goes in accordance with the results of Pon1 knockout model. Although it is known that insulin ang glucose dysregulation affects male reproductive function, the exact mechanisms by which insulin dysfunction mediates these effects remain largely unknown. Thus, we assessed the impact of primary hyperinsulinemia on male reproductive function. For that, we used a whole-body knockout model for Ide, the insulin-degrading enzyme (IDE). In the absence of IDE, insulin is not degraded in the liver, leading to hyperinsulinemia. Our results show that knockout mice for Ide mice present impaired testicular morphology. Moreover, these mice also present impaired sperm quality, namely a decrease in both sperm viability and morphology. Thus, this study provides evidence that IDE plays an important role in determining the reproductive potential of males. In conclusion, this research work demonstrated that high-fat and high-fructose diets have a different impact not only in overall glucose and insulin homeostasis, but also on insulin-sensitive tissues. Moreover, hepatic PON1 levels were found to be affected by these diets. By using a genetically modified mouse model, it was demonstrated that PON1 plays a role in glucose homeostasis, without affecting weight gain. After performing a cluster analysis in individuals with normoglycemia, prediabetes or T2DM, using POase activity along with lipid profile and renal function to inform the analysis, it was found that POase activity might be a valuable co-biomarker to refine dysmetabolic profiles with potentially different pathophysiological meaning. Lastly, IDE, by having a role in insulin homeostasis, contributes to a normal male reproductive function. Together, the individual studies that compose this dissertation demonstrate that PON1 and IDE play a role in the pathogenesis of obesity and prediabetes-associated co-morbidities.