RESUMO: A radioterapia é um tratamento amplamente utilizado no tratamento do cancro. Embora os efeitos da radiação ionizante (RI) nas células tumorais sejam bem conhecidos, é fundamental entender também a resposta das outras células que compõem o microambiente tumoral, como os macrófagos. O nosso grupo demonstrou que a exposição de macrófagos humanos a RI (5 x 2 Gy) aumenta a expressão do recetor da transferrina (TfR), um importante regulador do importe de ferro. No que diz respeito ao metabolismo deste elemento em macrófagos, a literatura indica que os macrófagos M1 apresentam um fenótipo de retenção de ferro, que limita o crescimento tumoral, enquanto que os macrófagos M2 apresentam um fenótipo de libertação de ferro, que contribui para a proliferação e sobrevivência das células tumorais. No entanto, os efeitos da RI no metabolismo do ferro em macrófagos nunca foram elucidados. Este projeto tem como objetivos: i) validar a sobreexpressão do TfR em macrófagos após irradiação in vivo; ii) compreender o impacto da RI no metabolismo do ferro em macrófagos; e iii) avaliar o papel do ferro na comunicação entre macrófagos e células tumorais irradiados. Primeiramente, realizámos uma análise imunohistoquímica para o TfR e F4/80, um marcador de linhagem de macrófagos, em tecido de cancro de mama proveniente de ratinhos irradiados e não irradiados, de modo a validar o aumento da expressão de TfR em macrófagos in situ. Subsequentemente, apresentamos a validação de um método semiquantitativo nessas amostras, nas quais observámos que a radiação ionizante tende a aumentar a expressão de TfR em células F4/80+ , corroborando os resultados obtidos in vitro. Realizámos também otimizações de imunofluorescência para avaliar a expressão de TfR em macrófagos presentes em tumores de reto provenientes de pacientes submetidos ou não a radioterapia. Em relação ao segundo objetivo, os nossos resultados mostram que macrófagos irradiados tendem a aumentar os níveis da proteína transportadora de metal divalente (DMT1), o que, juntamente com o aumento significativo do TfR, sugere um maior importe celular de ferro e transporte do mesmo para o citosol. Por outro lado, a falta de variação na expressão de ferritina (FTL) ou ferroportina (FPN) sugere que não há alterações no armazenamento nem na exportação de ferro dependente da ferroportina. No entanto, a irradiação levou a um aumento significativo da libertação de ferro por parte dos macrófagos, sem afetar os níveis de ferro intracelular. Adicionalmente, analisámos os níveis de lipocalina-2 (LCN2), um transportador de ferro prótumorigénico, em co-culturas de macrófagos e células tumorais rectais SW1463, tendo-se observado que a RI tende a aumentar a sua secreção. Neste sistema de co-cultura, as células SW1463 são as principais produtoras de LCN2, e não os macrófagos. Os macrófagos estimulam a produção de mRNA de LCN2 pelas células SW1463, que é exacerbada pela exposição a RI. Finalmente, considerando a maior libertação de ferro por macrófagos irradiados, desenhámos uma experiência para determinar se o ferro derivado dos macrófagos pode desempenhar um papel importante na estimulação da proliferação de células tumorais e como é que a irradiação pode influenciar este processo. Em conjunto, os nossos resultados indicam que os macrófagos irradiados adquirem um fenótipo de reciclagem de ferro, caracterizado por elevados níveis de internalização e libertação do mesmo, através de exportação independente da ferroportina. Estudos adicionais são necessários para investigar este mecanismo em macrófagos irradiados e para determinar como é que o seu fenótipo de metabolismo do ferro pode influenciar a progressão tumoral. Acreditamos que o nosso trabalho pode levar a uma melhor compreensão das bases moleculares das terapias que pretendem melhorar a eficácia da radioterapia e até mesmo contribuir para a criação de novas estratégias terapêuticas.

ABSTRACT: Radiotherapy is a widely used cancer treatment. Although the effects of ionizing radiation (IR) on cancer cells are well-known, it is crucial to also understand the response of tumorassociated host cells, such as macrophages. The Tumour and Microenvironment Interactions group demonstrated that human macrophages present increased expression of transferrin receptor (TfR), a major regulator of iron import, upon IR exposure (5 x 2 Gy). Regarding macrophage iron metabolism, the literature indicates that M1-like macrophages present an iron retention phenotype, which limits tumor growth, while M2-like macrophages present an iron release phenotype, which contributes to cancer cell proliferation and survival. However, the effects of IR exposure on macrophage iron metabolism have never been elucidated. This project aims at: i) validating the upregulation of TfR in macrophages upon in vivo irradiation; ii) understanding the impact of IR on macrophage iron metabolism; and iii) evaluating the role of iron on irradiated macrophage-cancer cell crosstalk. First, we performed immunohistochemistry for TfR and F4/80, a lineage macrophage marker, in breast cancer tissue from irradiated and non-irradiated mice, to evaluate macrophagic TfR expression in situ. Subsequently, we propose and validate a semi-quantitative analysis method for those samples, in which we observed that ionizing radiation tends to increase TfR expression in F4/80+ cells, supporting the results obtained in vitro. We have also performed immunofluorescence optimizations to assess macrophage TfR expression in human rectal cancer tissue, from patients subjected or not to radiotherapy. Regarding the second aim, our results show that irradiated macrophages tend to increase divalent metal transporter 1 (DMT1) protein levels, which together with the significant increase in TfR, suggest higher iron uptake and trafficking into the cytosol. On the other hand, lack of changes in ferritin (FTL) or ferroportin (FPN) expression suggest no alteration on iron storage nor on ferroportin-dependent iron export. However, irradiation led to a significant rise of macrophage iron release, without affecting intracellular iron levels. Additionally, we analyzed the levels of lipocalin-2 (LCN2), a pro-tumorigenic iron transporter, in SW1463-macrophage co-cultures and observed that IR tends to increase its secretion. In this co-culture system, SW1463 cells, rather than the macrophages, are the main LCN2 producers. Macrophages stimulate LCN2 mRNA production by SW1463 cells, which is further exacerbated by IR exposure. Finally, considering the higher iron release levels in irradiated macrophages, we have designed a cancer cell proliferation assay to determine if macrophage-derived iron can play a role in this process and how irradiation can influence it. Overall, our results indicate that irradiated macrophages acquire an iron recycling phenotype, characterized by both high iron uptake and release levels, through a ferroportin-independent iron export. Further studies are required to investigate this mechanism in irradiated macrophages and how their iron metabolism phenotype can influence cancer progression. We believe our work may lead to a better understanding of the molecular basis of therapies that aim to improve radiotherapy efficacy and even contribute to the design of new therapeutic strategies.