Normal view MARC view ISBD view

Genome editing to be applied in functional characterization of genetic variants in familial breast cancer patients / Ana Rita Serra Pedro ; orient. Susana Nunes da Silva

Main Author Pedro, Ana Rita Serra Secondary Author Silva, Susana Nunes da Language Inglês. Publication Lisboa : NOVA Medical School, 2021 Description xviii, 90 p. : il. Abstract RESUMO: O cancro da mama (CM) familiar representa 15% de todos os casos de CM, estando principalmente relacionado a variantes hereditárias nos genes BRCA. Vários genes ligados ao CM estão sobretudo relacionados com a Recombinação Homóloga (RH), a principal via de reparação de quebras de cadeia-dupla de DNA. A presença de variantes genéticas nestes genes, como o BRCA1 e BRCA2, pode comprometer a RH e consequentemente o desenvolvimento da doença. No cancro da mama familiar, o aconselhamento genético e a triagem através de testes genéticos têm se tornado padrão, aumentando a deteção de variantes de significado desconhecido (VUS). O efeito biológico atribuído às VUS é pouco claro, sendo necessários ensaios funcionais para caracterizar o seu significado clínico. Num estudo anterior, uma VUS foi identificada no gene BRCA1 em pacientes saudáveis, mas com histórico familiar de cancro relevante. Para estudar a sua relevância funcional, implementamos um modelo in vitro com linhas celulares de mama (MCF10-A e MCF-7) para introduzir a VUS de interesse com uma ferramenta de edição genómica, CRISPR-Cas9 e avaliar a resposta celular através de um desafio genotóxico com doxorrubicina (DOX). Introduzimos com sucesso a VUS como clone heterozigoto nas MCF10-A. Várias metodologias foram selecionadas para avaliar e comparar a resposta celular às lesões genéticas: ensaios do Cometa, ɣ-H2AX e Anexina V. Adicionalmente, avaliamos a expressão relativa da proteína através de Western Blot. Os resultados do ensaio do cometa mostram uma diminuição da sensibilidade à DOX no MCF10-A VUS, porém, no ensaio ɣ-H2AX, observamos um maior % de quebras e cadeia-dupla. Na Anexina V, o MCF10- A VUS apresentou menor % de células em necrose. Por último, a expressão da proteína BRCA1 encontra-se diminuída nas MCF10-A VUS. No geral, os resultados mostram uma diminuição da suscetibilidade à DOX para a linha celular com a VUS, sugerindo um efeito benigno. No entanto, são necessários mais ensaios funcionais para entender o seu papel no risco de cancro.
ABSTRACT: Familial breast cancer (BC) is responsible for 15% of all BC cases being mainly linked to inherited variants in BRCA genes. Several genes associated with BC are mostly related to Homologous Recombination (HR), the main pathway to repair DNA double-strand breaks. The occurrence of genetic variants in these genes, such as BRCA1 and BRCA2, might compromise the HR, thus the development of disease. In familial breast cancer the genetic counselling and the screening through genetic testing has been widespread increasing detection of variants of unknown significance (VUS). The biologic effect attributed to those VUS is mostly unclear, so functional assays need to be performed to characterize their mutational status. In a previous study a VUS was identified in the BRCA1 gene in healthy patients but with a relevant familial history of cancer. To study its functional relevance, we implemented an in vitro model using breast cell lines (MCF10-A and MCF-7). to introduce the VUS of interest with a genome editing tool, CRISPR-Cas9 and assess the cellular response through a genotoxic challenge with doxorubicin (DOX). We successfully established MCF10-A heterozygous clone for the VUS. Several methodologies were selected to evaluate and compare the cellular response to genetic lesions: Comet, ɣ-H2AX and Annexin V assays. Also, we assessed the protein relative expression using Western Blot. The comet assay results showed a decreased sensitivity to DOX in MCF10-A VUS, yet, in ɣ-H2AX assay, we observed a higher % DSB. In Annexin V, MCF10-A VUS showed lower % of cells in necrosis. Lastly, the expression of BRCA1 protein was decreased in MCF10-A VUS. Overall, the results show a decreased susceptibility to DOX for the VUS cell line, suggesting a benign behaviour. Nonetheless more functional assays need to be performed to understand their role on cancer risk.
Topical name BRCA1
Variants of Unknown Significance (VUS)
Breast Neoplasms
MCF10-A
Academic Dissertation
Index terms Dissertação de Mestrado
Mestrado em Bioquímica para a Saúde
Universidade NOVA de Lisboa
NOVA Medical School
2021
CDU 616
Tags from this library: No tags from this library for this title. Log in to add tags.
    average rating: 0.0 (0 votes)
Holdings
Item type Current location Call number url Status Date due Barcode
Documento Eletrónico Biblioteca NMS|FCM
online
RUN http://hdl.handle.net/10362/114625 Available 20210091

RESUMO: O cancro da mama (CM) familiar representa 15% de todos os casos de CM, estando principalmente relacionado a variantes hereditárias nos genes BRCA. Vários genes ligados ao CM estão sobretudo relacionados com a Recombinação Homóloga (RH), a principal via de reparação de quebras de cadeia-dupla de DNA. A presença de variantes genéticas nestes genes, como o BRCA1 e BRCA2, pode comprometer a RH e consequentemente o desenvolvimento da doença. No cancro da mama familiar, o aconselhamento genético e a triagem através de testes genéticos têm se tornado padrão, aumentando a deteção de variantes de significado desconhecido (VUS). O efeito biológico atribuído às VUS é pouco claro, sendo necessários ensaios funcionais para caracterizar o seu significado clínico. Num estudo anterior, uma VUS foi identificada no gene BRCA1 em pacientes saudáveis, mas com histórico familiar de cancro relevante. Para estudar a sua relevância funcional, implementamos um modelo in vitro com linhas celulares de mama (MCF10-A e MCF-7) para introduzir a VUS de interesse com uma ferramenta de edição genómica, CRISPR-Cas9 e avaliar a resposta celular através de um desafio genotóxico com doxorrubicina (DOX). Introduzimos com sucesso a VUS como clone heterozigoto nas MCF10-A. Várias metodologias foram selecionadas para avaliar e comparar a resposta celular às lesões genéticas: ensaios do Cometa, ɣ-H2AX e Anexina V. Adicionalmente, avaliamos a expressão relativa da proteína através de Western Blot. Os resultados do ensaio do cometa mostram uma diminuição da sensibilidade à DOX no MCF10-A VUS, porém, no ensaio ɣ-H2AX, observamos um maior % de quebras e cadeia-dupla. Na Anexina V, o MCF10- A VUS apresentou menor % de células em necrose. Por último, a expressão da proteína BRCA1 encontra-se diminuída nas MCF10-A VUS. No geral, os resultados mostram uma diminuição da suscetibilidade à DOX para a linha celular com a VUS, sugerindo um efeito benigno. No entanto, são necessários mais ensaios funcionais para entender o seu papel no risco de cancro.

ABSTRACT: Familial breast cancer (BC) is responsible for 15% of all BC cases being mainly linked to inherited variants in BRCA genes. Several genes associated with BC are mostly related to Homologous Recombination (HR), the main pathway to repair DNA double-strand breaks. The occurrence of genetic variants in these genes, such as BRCA1 and BRCA2, might compromise the HR, thus the development of disease. In familial breast cancer the genetic counselling and the screening through genetic testing has been widespread increasing detection of variants of unknown significance (VUS). The biologic effect attributed to those VUS is mostly unclear, so functional assays need to be performed to characterize their mutational status. In a previous study a VUS was identified in the BRCA1 gene in healthy patients but with a relevant familial history of cancer. To study its functional relevance, we implemented an in vitro model using breast cell lines (MCF10-A and MCF-7). to introduce the VUS of interest with a genome editing tool, CRISPR-Cas9 and assess the cellular response through a genotoxic challenge with doxorubicin (DOX). We successfully established MCF10-A heterozygous clone for the VUS. Several methodologies were selected to evaluate and compare the cellular response to genetic lesions: Comet, ɣ-H2AX and Annexin V assays. Also, we assessed the protein relative expression using Western Blot. The comet assay results showed a decreased sensitivity to DOX in MCF10-A VUS, yet, in ɣ-H2AX assay, we observed a higher % DSB. In Annexin V, MCF10-A VUS showed lower % of cells in necrosis. Lastly, the expression of BRCA1 protein was decreased in MCF10-A VUS. Overall, the results show a decreased susceptibility to DOX for the VUS cell line, suggesting a benign behaviour. Nonetheless more functional assays need to be performed to understand their role on cancer risk.

There are no comments for this item.

Log in to your account to post a comment.