Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa

RESUMO: O cancro da mama (CM) é a principal causa de mortalidade por cancro em mulheres, sendo responsável por cerca de 684,996 óbitos em 2020, 15.5% de todas as mortes. Embora a quimioterapia aumente as taxas de sobrevivência, muitos pacientes acabam por sofrer recidivas. A principal causa da falha terapêutica é a resistência a fármacos (DR). A identificação de novos alvos terapêuticos para superar a DR é um desafio constante na quimioterapia. Portanto, a identificação de biomarcadores de DR pode auxiliar na monitorização da progressão da doença, resposta ao tratamento e na identificação de alvos terapêuticos. DR está frequentemente associada à sobreexpressão de transportadores transmembranares de efluxo, como ABCB1. Porém, dados anteriores mostraram que a sua expressão varia ao longo do tempo, impossibilitando o seu uso como biomarcadores. MicroRNAs (miRNAs) modulam a expressão génica, regulando várias vias celulares, e foram descritos níveis aberrantes de miRNA associados a DR. Assim, desenvolvemos uma linha celular de CM MCF-7 resistente a 25 e 35 nM de doxorrubicina (DOX). Realizamos ensaios de viabilidade como o MTT e ensaios funcionais para avaliar o efluxo por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo, e a expressão da proteína ABCB1 por microscopia de imunofluorescência e Western blot. Perfis de expressão de miRNA e seus potenciais alvos foram avaliados. Células resistentes a DOX não apresentaram aumento de efluxo, contudo, há um ligeiro aumento da proteína ABCB1 em células MCF-7/DOX 35 nM. Uma análise de expressão global de > 2000 miRNAs nas células MCF-7/DOX 25 nM revelou 171 miRNAs diferencialmente expressos em comparação com as MCF-7, com alvos putativos. Na nossa análise, ABCB1 não representa um fator preponderante na fase inicial da resistência à DOX. Todavia, já são visíveis mudanças epigenéticas. Estudos futuros devem ser realizados ao longo do estabelecimento da resistência, a fim de avaliar fatores críticos neste processo.

ABSTRACT: Breast cancer (BC) is the major cause of cancer-related deaths in women, being responsible for an estimated 684,996 deaths in 2020, comprising 15.5 % of all deaths. Although chemotherapy improves survival rates, many patients undergoing this treatment end up relapsing. The major reason for therapeutic failure is drug resistance (DR). The identification of novel therapeutic targets to overcome DR is a challenge in drug discovery and development. Therefore, the identification of DR biomarkers can assist in monitoring disease progression and treatment response and identify druggable targets. DR is often associated with overexpression of transmembrane efflux transporters, such as ABCB1, associated with increased drug efflux. However, previous data showed that expression of ABC transporters varies over time, precluding their use as biomarkers. MicroRNAs (miRNAs) modulate gene expression, affecting several cell pathways, and previous studies have reported aberrant miRNA levels associated with DR. Therefore, we developed an MCF-7 breast cancer cell line resistant to 25 nM and 35 nM doxorubicin (DOX). We then performed viability assays such as MTT and functional assays to evaluate ABCB1 activity by fluorescence microscopy and flow cytometry, and ABCB1 protein expression by immunofluorescence microscopy and Western blot. Furthermore, miRNA profiles from parental MCF-7 cells and resistant cells were obtained, as well as their potential targets. DOX resistant cells did not increase ABCB1 efflux pump activity, however there is a slight increase of ABCB1 protein in MCF-7/DOX 35 nM cells. A global expression analysis of >2000 miRNAs in the MCF-7/DOX 25 nM cells revealed 171 differentially expressed miRNAs compared to parental cells, with putative targets. From our analysis, ABCB1 does not represent an important factor in early-on establishment of DOX-resistance. However, epigenetic changes are already visible. Future studies should be carried out throughout the establishment of DR in order to assess critical factors in this process.