RESUMO: O objetivo geral deste projeto visou dar resposta a uma necessidade premente na prática clínica, que é o diagnóstico da disfunção tubular. Este conhecimento não só permitirá o diagnóstico precoce desta disfunção, como também o desenvolvimento de estratégicas terapêuticas que permitiam travar a progressão da doença renal, que neste momento são inexistentes. Por outro lado, teria uma importância significativa no desenvolvimento de estratégias para minimizar a toxicidade tubular induzida por fármacos e por substâncias utilizadas nos métodos de diagnóstico, que representam um desafio major na prática clínica. Por último, este conhecimento teria também valor acrescentado nos testes préclínicos do desenvolvimento de novos fármacos. Existe uma forte correlação entre o grau de dano no compartimento túbulo-intersticial e o decréscimo da função renal. Além disso, o papel principal do rim como órgão de destoxificação torna-o vulnerável ao desenvolvimento de várias formas de lesão. Motivados pela actividade destoxificante relevante e pela sua principal expressão nas células tubulares proximais, a via dos mercapturatos foi escolhida como ponto de partida para esta investigação baseada no mecanismo para a identificação de um biomarcador fidedigno que reflita a disfunção tubular. O nosso interesse recaiu particularmente sobre a N-acetiltransferase 8 (NAT8), a última enzima da via do mercapturatos, que acetila os S-conjugados da cisteína (Cis-S-conjugados), possibilitando a sua eliminação urinária. Os Cis-S-conjugados podem ser mais tóxicos do que os seus compostos de origem. A formação dos Cis-S-conjugados já foi reportada em doenças inflamatórias e o nosso grupo escreveu uma revisão baseada numa hipótese da sua contribuição e da contribuição da NAT8 como um balanceador da sua disponibilidade, exemplificada por uma visão tubulocêntrica da nefropatia diabética. Tendo em conta que o rim é altamente suscetível à oxidação e é exposto a concentrações relativamente altas de cisteína (Cis), que se torna facilmente oxidada promovendo a acumulação dos seus dissulfetos (nas suas formas livre e ligada a proteínas), considerámos que a quantificação dos dissulfetos poderia ser um ponto de partida para a identificação de novos marcadores de disfunção tubular. Numa primeira etapa, foi desenvolvido um método não invasivo que permitiu fenotipar os doentes como menores ou maiores destoxificadores de Cis-S-conjugados, tendo por base a atividade da NAT8, que foi reconhecida como um fator nefroprotetor, expressa principalmente nas células tubulares proximais. Este método quantifica os mercapturatos dos Cis-S-conjugados que são dissulfetos (CisSSX). A fração de N-acetilcisteína destes mercapturatos foi quantificada, que denominamos de uNAC, como um equivalente da destoxificação dos CisSSX. No Capítulo I, é apresentado a justificação para os mercapturatos de CisSSX serem considerados indicadores de disfunção tubular e para o desenvolvimento e validação do método. O método desenvolvido foi validado e aplicado em urinas de indivíduos com rim saudável e com doença renal, bem como em urinas de murganhos e ratos. Neste capítulo foi demonstrado que os CisSSX são acetilados e eliminados na urina como mercapturatos. Tanto os ratos como os murganhos apresentaram níveis mais elevados de uNAC do que o homem. Não foi observada qualquer variabilidade intra-individual para os níveis de uNAC nas amostras de urina de ratos e murganhos. Além disso, foram observados níveis mais baixos de uNAC na urina de quatro doentes que progrediram para doença renal crónica (DRC) após um episódio de lesão renal aguda (LRA), em comparação com voluntários. Com o intuito de avaliar o potencial do uNAC como indicador precoce de LRA, as concentrações de uNAC foram avaliadas em dois modelos animais de LRA induzida por fármacos (Capítulo II). A cisplatina (CISP) foi escolhida porque é uma toxina tubular que é metabolizada pela via dos mercapturatos. No caso da gentamicina (G), este fármaco também promove disfunção tubular, mas não é substrato da via dos mercapturatos. Para isso, ratos Wistar machos foram colocados em gaiolas metabólicas individuais e divididos aleatoriamente em três grupos: (1) grupo controlo (CTL), expostos ao veículo diariamente via intraperitoneal durante 6 dias; (2) grupo CISP, expostos a uma única dose (via intraperitoneal) de CISP (5 mg/kg); e (3) grupo G, expostos diariamente a uma dose de G (150 mg/kg) por via intraperitoneal durante 6 dias. Os níveis de uNAC diminuíram antes do aumento da pCr, particularmente no modelo da CISP (p < 0.001). Esta tendência também foi observada em ratos tratados com G, apesar de só atingir significância mais tardiamente que a CISP (p = 0.044). De seguida, considerámos interessante avaliar a variabilidade inter-individual do uNAC e os fatores que poderiam influenciar os seus níveis. Para isso, os níveis de uNAC foram medidos numa população de doentes infetados pelo vírus da imunodeficiência humana (VIH) como prova de conceito (Capítulo III). Os níveis de uNAC variaram muito (59%) entre 242 doentes infetados pelo VIH. Através de uma análise multivariada foi demonstrado que os níveis de uNAC estavam associados positivamente com a taxa de filtração glomerular estimada (TFGe) (p = 0.020) e negativamente associada ao uso de lamivudina (3TC) (p = 0.019) e à raça negra (p < 0.001). Além disto, a análise prospetiva do uNAC em 118 doentes infetados pelo HIV permitiu discriminar doentes com progressão da doença renal daqueles que mantiveram uma função renal estável, o que pode implicar alterações na disponibilidade e dinâmica dos dissulfetos de cisteína na progressão da doença renal. De seguida, fomos avaliar as alterações temporais da dinâmica dos dissulfetos de cisteína e do uNAC em modelos de doenças crónicas que afectam o rim, com o objectivo de avaliar se estas alterações precedem a disfunção renal e a sua relação com o desenvolvimento da doença (ex: hipertensão e resistência à insulina). Assim, foram selecionamos modelos animais associados à inflamação metabólica, dois modelos de murganho com pré-diabetes induzida por dieta rica em frutose (HFruct) e por dieta hipercalórica (HFat) durante 15 semanas (Capítulo IV); e um modelo de hipertensão e resistência à insulina induzido por hipoxia crónica intermitente (HCI) até um máximo de 60 dias (Capítulo V). Nos três modelos, a progressão e severidade da doença são moderadas, o que é apropriado para estudar alterações temporais da disfunção tubular renal e a sua relação com o desenvolvimento de hipertensão e resistência à insulina. Os animais HFat apresentaram menor eliminação de uNAC imediatamente após 1 semana de exposição à dieta, enquanto que o grupo HFruct apresentou um ligeiro aumento. No entanto, a cronicidade da exposição às dietas diminuiu os níveis de uNAC até ao final do estudo, que foi particularmente evidente para o modelo HFat (45% menor que o grupo controlo – Chow; p = 0.005). Além disso, as frações de Cis aumentaram no grupo HFruct (p = 0.046, p = 0.045 e p = 0.017, respetivamente para as formas total, livre total e ligada a proteínas da Cis), enquanto que a dieta HFat provocou uma diminuição geral (p = 0.028, p = 0.065 e p = 0.049, respetivamente, para as formas total, livre total e ligada a proteínas da Cis). Embora não tenha sido observada uma patologia renal clara nos grupos prédiabéticos, alterações na relação albumina/creatinina na urina (uACR) foram observadas mais cedo e mais evidentes no grupo HFat em comparação com o grupo HFruct. O grupo HFat também apresentou maior expressão renal de NAT8 (p = 0.001), de marcadores fibróticos e de enzimas do metabolismo da glucose e de lípidos. Ambas as dietas induziram aumentos na expressão renal de marcadores de inflamação, de transição epitelial para mesenquimal e de stress do retículo endoplasmático. No primeiro dia de exposição à HCI, houve um aumento agudo de quase 100% de uNAC em comparação com animais normóxicos (Nx). Posteriormente, os níveis de uNAC diminuíram ao longo do tempo, atingindo uma diferença de -80% no grupo HCI versus Nx (p < 0.001). A expressão renal da NAT8 diminuiu inicialmente nos dias 1 (p = 0.006 para o córtex renal – CR; p = 0.041 para a medula renal – MR) e 7 (p = 0.021 para o CR e p = 0.024 para a MR) de exposição à HCI, aumentando aos 21 dias, quando a hipertensão foi estabelecida, mas antes do estabelecimento da resistência à insulina. Os níveis de uNAC voltaram a diminuir aos 60 dias (p = 0.037 para o CR e p = 0.024 para a MR), coincidente com o aumento mencionado anteriormente da expressão de fibronectina renal. Aos 7 dias de exposição à HCI, observou-se no rim um aumento da Cis total (p = 0.003 para o CR e p = 0.001 para a MR) e CisSSP (p = 0.041 para o CR e p = 0.028 para a MR), diminuindo ainda mais com a cronicidade da exposição à HCI (p < 0.001). Foi também observado um aumento do rácio de Cis livre/CisSSX no dia 7 (p = 0.008 para o CR e p = 0.017 para a MR), indicativo de um estado mais reduzido da Cis, diminuindo do dia 14 para 21 (p < 0.001) e regressando a valores mais próximos das condições de controlo no final do ensaio. No entanto, no fim do estudo não foram observadas alterações histológicas nem alterações nos níveis de uACR, apesar de haver uma tendência de aumento nos animais exposto à HIC. Este trabalho forneceu provas para responder à falta de marcadores de disfunção tubular, uma necessidade que deriva maioritariamente ao facto de ser importante compreender melhor os mecanismos patofisológicos inerentes a esta condição. Em segundo lugar, foi desenvolvido um método para avaliar a disfunção tubular de forma não invasiva. Por fim, e apesar de serem ainda dados preliminares, este trabalho gerou conhecimentos novos baseados numa hipótese que, tanto quanto sabemos, é um assunto inovador e que nunca antes foi abordado, e que pode guiar na identificação de novos mecanismos de doenças inflamatórias através de uma perspetiva tubulocêntrica. Os dados preliminares aqui reportados suportam o uNAC como um indicador de progressão de disfunção tubular. A nossa abordagem mostra que a dinâmica dos Cis-Sconjugados está alterada ao longo da progressão da doença. Os resultados sugerem que esta dinâmica pode estar associada não só a mecanismos de adaptação, com aumentos na CisSSP e uNAC, mas também a mecanismos de progressão de doença que a cronicidade da lesão, caracterizado por alterações opostas nesta dinâmica. A translação destes resultados juntamente com o aprofundamento deste estudo pode levar à identificação de novos alvos terapêuticos para desacelerar ou parar a progressão da doença e para estabelecer estratégicas preventivas alcançadas pelo diagnóstico precoce. Além disso, a identificação de um novo marcador pode também ajudar a avaliar o sucesso das estratégias de prevenção e gestão.

ABSTRACT: The general objective of this project was to respond to a pressing need in clinical practice, which is the diagnosis of tubular dysfunction. This knowledge would not only allow the prediction of the early onset and progression of tubular dysfunction, but also the management of strategies to stop the progression of renal disease, which at present are non-existent. On the other hand, it would be of significant importance in the development of strategies to minimize tubular toxicity induced by drugs and substances used in diagnostic methods that pose a major challenge in clinical practice. It would also have added value in the preclinical tests in drug development. There is a good correlation between the degree of damage to the tubulo-interstitial compartment and the deterioration of renal function. Moreover, the primary role of kidney as a detoxification organ renders it vulnerable to develop various forms of injury. Motivated by the relevant detoxification activity and its main expression in kidney proximal tubular cells, the mercapturate pathway was chosen as a starting point of this mechanistic-based investigation for a reliable biomarker reflective of tubular dysfunction. We were particularly interested in N-acetyltransferase 8 (NAT8), the last enzyme of the mercapturate pathway, that acetylates cysteine-S-conjugates (Cys-S-conjugates), rendering their urinary elimination. Cys-S-conjugates can be more toxic than the parent compounds. The formation of Cys-S-conjugates have been reported in inflammatory diseases and a hypothesis-based review of their contribution and the contribution of NAT8 as a balancer of their availability was built up exemplified by a tubular view of diabetic nephropathy. As the kidney is highly susceptible to oxidative conditions and is exposed to relatively high concentrations of cysteine (Cys), which becomes easily oxidized, promoting the accumulation of its disulfides (in both the free and protein forms), we though that the measurement of Cys-S-conjugates which are disulfides could be a starting point for the identification of new markers of tubular dysfunction. With the general goal of non-invasively evaluate kidney tubular dysfunction, it was first needed to develop a method that allowed to phenotype patients as higher or lower Cys-Sconjugates detoxifiers inspired on the activity of NAT8, which has been recognized as a nephroprotective factor mainly expressed in proximal tubular cells. This method quantifies the mercapturates of Cys-S-conjugates that are disulfides (CysSSX). We measured the N-acetylcysteine moiety of these mercapturates, that we named uNAC, as a surrogate of detoxification of CysSSX. In Chapter I, the rationale for the mercapturates of CysSSX as indicators of tubular dysfunction and for method development and validation is presented. The developed method was validated and applied to urine from individuals with healthy kidney and kidney disease as well as to urine from mice and rats. We have shown that CysSSX are acetylated and eliminated in urine as mercapturates. Rats and mice showed higher levels of uNAC than man. No intra-individual variability was found for uNAC levels in urine samples from rats and mice. In addition, lower levels of uNAC were found in urine of four patients that progressed to chronic kidney disease (CKD) after an episode of acute kidney injury (AKI) in comparison with volunteers. In order to evaluate the potential of uNAC as an early indicator of AKI, we measured uNAC concentrations in two animal models of drug-induced AKI (Chapter II). Cisplatin (CISP) was chosen because is a tubular toxicant that undergoes the mercapturate pathway and gentamicin (G) also promotes tubular dysfunction, but it does not undergo this metabolic circuitry. For this, male Wistar rats were allocated in individual metabolic cages and randomly divided into three groups: (1) control group (CTL), receiving daily vehicle intraperitoneal for 6 days; (2) cisplatin group (CISP), receiving a single intraperitoneal dose of cisplatin (5 mg/kg); and (3) gentamicin group (G), receiving gentamicin intraperitoneal (150 mg/kg) for 6 days. The levels of uNAC decreased prior to the increase in pCr, particularly in CISP model (p < 0.001). This tendency was also observed for rats treated with G, despite only reaching significance belatedly than CISP (p = 0.044). Next, we were interested to know the inter-individual variability of uNAC in man and factors that could influence it. For that, uNAC was measured in a population of humanimmunodeficiency virus (HIV)-infected patients as a proof-of-principle (Chapter III). The levels of uNAC varied highly (59%) among 242 HIV-infected patients. A multivariable analysis showed that the levels of uNAC were positively associated with estimated glomerular filtration rate (eGFR) (p = 0.020) and negatively associated with lamivudine use (3TC) (p = 0.019) and Black race (p < 0.001). Notably, a prospective analysis of uNAC in 118 HIV-infected patients allowed to discriminate patients on kidney disease progression from those that maintained a stable renal function, that might imply changes in cysteine disulfides availability and dynamics in kidney disease progression. Thus, the next step was to evaluate the temporal changes of cysteine disulfides dynamics and uNAC in models of chronic diseases that affect the kidney, aiming to evaluate if they are prior to kidney dysfunction and also its relation to disease development (e.g. hypertension, insulin resistance). For that, we selected animal models associated with metabolic inflammation, namely two pre-diabetic mice models induced by high fructose (HFruct) or hypercaloric (HFat) diet for 15 weeks (Chapter IV); and a rat model of hypertension and insulin resistance induced by chronic intermittent hypoxia (CIH) to a maximum of 60 days (Chapter V). In the three models the disease progression and severity diseases are mild, being appropriated to study temporal changes of kidney tubular dysfunction and its relation to the development of hypertension and insulin resistance. HFat animals presented lower uNAC right after 1 week of exposure to the diet while the HFruct group presented a mild increase. Nevertheless, the increment on the chronicity of exposure to the diets decreased uNAC until the end of the study, that was particularly evident for HFat model (45% lower than Chow group, p = 0.005). Moreover, Cys availability and protein cysteinylation (CysSSP) increased in HFruct (p = 0.046, p = 0.045 and p = 0.017, respectively for total, free total and CysSSP); while HFat diet induced an overall decrease (p = 0.028, p = 0.065 and p = 0.049, respectively for total, free total and CysSSP fractions). Although no clear renal pathology was observed in both pre-diabetic groups at the end of the study, changes in urinary albumin-to-creatinine ratio (uACR) were earlier and more evident in the HFat, comparing with the HFruct group. HFat mice also presented higher renal expression of NAT8 (p = 0.001), fibrotic markers and enzymes of glucose and lipid metabolism. Both diets induced increases in the renal expression of inflammatory, epithelial to mesenchymal transition and endoplasmic reticulum stress markers. In the first day of exposure to CIH, there was an acute increase of almost 100% in uNAC in comparison with normoxic (Nx) animals. Afterwards, its levels decreased overtime, reaching a difference of -80% in CIH versus Nx group (p < 0.001). Kidney NAT8 gene expression initially decreased at days 1 (p = 0.006 for renal cortex – RC; p = 0.041 for renal medulla – RM) and 7 (p = 0.021 for RC and p = 0.024 for RM) of CIH exposure, further increasing at 21 days when hypertension is established but prior to the establishment of insulin resistance, and decreased at 60 days (p = 0.037 for RC and p = 0.024 for RM), coincident with the previously reported increase in renal fibronectin expression. At 7 days of CIH exposure, an increase in renal total Cys (p = 0.003 for RC and p = 0.001 for RM) and CysSSP (p = 0.041 for RC and p = 0.028 for RM) was observed, further decreasing with the chronicity of exposure to CIH (p < 0.001). An increase was also observed in the ratio of free Cys by CysSSX at day 7 (p = 0.008 for RC and p = 0.017 for RM), indicative of a more reduced state of Cys, decreasing from day 14 to 21 (p < 0.001) and returning to values closer to control conditions by the end of the experiment. Nevertheless, at the end of the study, no histological alterations were observed neither changes in uACR, despite there was a tendency to increase in CIH animals. Herein, we provided evidence in order to respond to a lack of tubular dysfunction markers, a necessity that is mostly driven due to the need to better understand the pathophysiological mechanisms underlying it. Secondly, a method was developed to evaluate tubular dysfunction in a non-invasive manner. Lastly and although still very preliminary, new knowledge was herein provided based on a hypothesis that, as far as the author knowledge, is an innovative and never addressed issue that could pave the way for the identification of new mechanisms of inflammatory diseases through a tubulocentric perspective. The preliminary data herein reported supports uNAC as an indicator of tubular dysfunction progression. Our approach shows that Cys-S-conjugate’s dynamics changes throughout disease progression. The results support that this dynamic might be associated not only to adaptive mechanism, with increases in CysSSP and uNAC, but also to mechanisms of disease progression with the chronicity of injury, characterized by opposite changes on this dynamic. The translation of these results together with the deepening of this study might lead to the identification of new therapeutic targets to slow down or stop disease progression and to establish preventive strategies achieved through early diagnosis. Furthermore, the identification of a new marker could also help to evaluate the success of preventive/management strategies.