RESUMO
O cancro de mama familiar é responsável por quase 15% de todos os casos de cancro de mama e é
predominantemente devido a mutações herdadas dos genes BRCA1 e BRCA2. Outros genes também foram
descritos como vinculados ao desenvolvimento do cancro de mama, assim como com a recombinação homóloga
(HR), uma das principais vias de reparação de quebras de cadeia dupla do DNA. Nos últimos anos, muitos
avanços foram feitos na sequenciação, através da ampla sequenciação de nova geração (NGS), bem como ao
estabelecimento de painéis clínicos estendido a vários genes e, desde que os testes genéticos se tornaram norma,
tem existido uma maior deteção de variantes de significado desconhecido (VUS) sem diretrizes clínicas
estabelecidas. Estas VUS podem tanto ser patogénicas como benignas. Porém, o seu efeito não é claro, como tal
há necessidade de realizar ensaios funcionais para categorizar o seu estado mutacional. No entanto, é preciso
recolher o sangue dos pacientes para realizar tais ensaios. Como tal, ao usar uma ferramenta de edição genómica,
como o CRISPR-Cas9, seria possível introduzir a VUS dos pacientes numa linha de células da mama nãotumorais, MCF10-A. A metodologia CRISPR-Cas9 é baseada no recrutamento da nuclease Cas9 pelo sgRNA
para o locus alvo e, por complementaridade, leva à indução de uma quebra de cadeia dupla. Estas podem ser
reparadas por HR, dependente de uma sequência de nucleótidos de cadeia simples (ssODN), ou por NHEJ,
propensa a erros. O primeiro passo foi estabelecer o modelo celular, introduzindo sgRNA e ssODN, criados
através de uma ferramenta bioinformática, num plasmídeo pSpCas9 (BB), pX458. Após a construção do pX458
sgRNA ssODN, este foi transfetado nas células MCF10-A, onde o isolamento e seleção de clones foram
realizados célula-a-célula por citometria de fluxo. Posteriormente, verificámos se a mutação foi realmente
inserida por PCR e sequenciação Sanger. A intenção era criar três linhas celulares: MCF10-A não-tumoral, o
controlo negativo; MCF10-A homozigótico para a VUS, o controlo positivo, e aquele que reproduziria melhor
os pacientes, MCF10-A heterozigótico para a VUS. Estas células iriam ser submetidas a três tratamentos
diferentes, doxorrubicina (DOX), peróxido de hidrogénio (H2O2) e inibidores da PARP (PARPi), de modo a se
poder avaliar e comparar a lesão induzida no DNA nas três linhas celulares através de ensaios funcionais, como
o ensaio do cometa, que mede baixos níveis de dano no DNA e ɣ-H2AX, que mede quebras de cadeia dupla no
DNA. As linhas celulares com a VUS, homozigóticas e heterozigóticas, ainda não foram estabelecidas, portanto,
avaliámos apenas o dano induzido no DNA da linha celular MCF10-A não-tumoral. Os resultados são os
esperados, no ensaio do cometa, o H2O2 50µM (controlo positivo) cria maior % de DNA na cauda representativo
da % de lesão, seguido pela DOX 5µM. DOX 0,1µM e DOX 1µM não são estatisticamente diferentes do controlo
negativo (sem tratamento). Por outro lado, as células MCF10-A aumentaram a sua sensibilidade à DOX 1µM e
à DOX 5µM (controlo positivo), uma vez que possuem uma maior %ɣ-H2AX, o que significa que originam mais
cadeias de quebra dupla no DNA, enquanto que nenhuma das concentrações de H2O2 ou de PARPi apresentam
diferenças significativas em relação ao controlo negativo. No entanto, é preciso estabelecer as células MF10-A
com a VUS para entender a sua função, assim como o seu papel no risco de desenvolvimento de cancro.

ABSTRACT: Familial breast cancer accounts for almost 15% of all breast cancer cases, and it is predominantly due to inherited mutations on BRCA1 and BRCA2 genes. Some other genes have also been described to be linked to breast cancer development, as well as, with Homologous Recombination (HR), which is one of the main pathways to repair DNA double-strand breaks (DSBs). In recent years, many advances have been made in sequencing, through the widespread of next-generation sequencing (NGS), each clinical panel has been extended to numerous genes, and since genetic testing has become standard, there has been an increased detection of variants of unknown significance (VUS) without established clinical guidelines. These VUS can either be pathogenic or benign, but since their effect is unclear, functional assays need to be performed to categorise their mutational status. Nevertheless, there is still a need to take the patient’s blood in order to perform such assays. Hence, by using a genome-editing tool, such as CRISPR-Cas9, we would be able to introduce the VUS found in the patients into a non-tumorigenic breast cell line, MCF10-A. CRISPR-Cas9 methodology is based on the sgRNA recruitment of the Cas9 nuclease to the specific target locus and, by complementarity, the induction of a DSB. These can be repaired either by HR, which is dependent on a repair template (single-stranded DNA oligonucleotides – ssODN) or NHEJ, which is error-prone. So, the first step was to establish our cellular model by introducing the sgRNA and ssODN, previously created through a CRISPR design tool and place them into a pSpCas9(BB) plasmid, pX458. After constructing the pX458 sgRNA ssODN, it was transfected into the MCF10-A cells, where single-cell clone isolation and selection was performed by flow cytometry. Afterwards, we verified if the desired point mutation was indeed inserted through PCR and sequencing. The intent was to create three cell lines: the non-tumorigenic MCF10-A, negative control; MCF10-A homozygous for the VUS, positive control and the one which would mimic the patients the best, MCF10-A heterozygous for the VUS. These cells would undergo a genotoxic challenge using three different drugs, doxorubicin (DOX), hydrogen peroxide (H2O2) and PARP inhibitors (PARPi) to assess and compare the DNA damage induced in the three cell lines through functional assays, such as comet assay, which measures low levels of DNA damage, and ɣ-H2AX flow cytometry, which measures DNA DSBs. The cell lines with VUS, homozygous and heterozygous, have not been established yet, so we have only evaluated the DNA damage in the non-tumorigenic MCF10-A cell line. The results are as expected, in the comet assay H2O2 50μM, the positive control, has the highest %DNA in tail, followed by DOX 5μM. Both DOX 0.1μM and DOX 1μM are not statistically different from the negative control (no drug added). On the other hand, MCF10-A cells have increased sensitivity to DOX 1μM and DOX5μM (positive control), since they have higher %ɣ-H2AX, which means they originate more DNA DSBs, whereas none of H2O2 nor PARPi concentrations present significant differences from the negative control. Nevertheless, we still need to establish the MF10-A cells with the VUS in order to understand their function, as well as their role on cancer risk.