Tese de Doutoramento Mecanismos de Doença e Medicina Regenerativa 2019 Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa

RESUMO: Apesar de todo o progresso na prevenção e no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas, o cancro é a segunda principal causa de morte a nível mundial. Cancro refere-se a um conjunto de doenças complexas, sendo que existem mais de 200 diferentes tipos de cancro. No entanto, foi proposto que as alterações fisiopatológicas implicadas na transformação maligna são comuns à maioria dos tumores humanos: auto-suficiência em sinais estimuladores de proliferação celular (mitogénese), insensibilidade a sinais que inibem a proliferação, evasão da morte celular programada, capacidade de replicação ilimitada, indução de angiogénese, capacidade de invasão de tecidos e de metastização, reprogramação do metabolismo energético e evasão ao sistema imunitário. Tanto a incidência como a mortalidade por cancro têm vindo a aumentar, não só devido ao envelhecimento e crescimento populacionais mas também devido ao aumento da exposição a factores de risco tais como o tabaco e obesidade. O cancro do ovário não é exceção a este cenário, sendo o terceiro tipo de cancro ginecológico mais comum e a principal causa de morte de cancro ginecológico. Cancro do ovário define um conjunto de neoplasias distintas, sendo os carcinomas (neoplasia malignas com origem epithelial) o grupo dominante. Apesar de nos últimos 30 anos se ter observado um aumento da sobrevivência de pacientes com esta doença, não se observou um aumento na taxa de cura. O mau prognóstico associado ao cancro do ovário deve-se essencialmente a um diagnóstico tardio e à emergência de resistência à terapia convencional, dificultando o tratamento da doença. O tratamento do cancro do ovário envolve geralmente cirurgia citorredutora e terapia combinada de sais de platina e de taxanos, ambos agentes oxidativos. Estes fármacos impõem pressões seletivas muito fortes nas células neoplásicas, seleccionando células resistentes responsáveis pela progressão e recidiva da doença. A quimioresistência contribui assim para uma grande morbilidade e mortalidade da doença. Recentemente, o metabolismo do cancro adquiriu uma relevância central em oncobiologia, sendo a remodelação metabólica uma característica necessária para a progressão tumoral, permitindo que as células cancerígenas respondam e se adaptem a inúmeras pressões seletivas diferentes impostas pelo microambiente tumoral, tais como hipóxia, acidez e presença de fármacos citotóxicos. O papel da cisteína em cancro já foi demonstrado devido ao seu envolvimento como percursor de dois compostos essenciais: o glutatião (GSH) e o sulfureto de hidrogénio (H2S). O GSH é o tiol não proteico mais abundante em células de mamífero, desempenhando diversas funções biológicas tais como uma função antioxidante, e destoxificante, constituindo um mecanismo de quimioresistência em vários tipos de tumores. Por sua vez, o H2S está também envolvido em vários processos biológicos, tendo também um papel antioxidante e estando também associado a progressão tumoral e quimioresistência. Durante o crescimento dos tumores sólidos, como os tumores de ovário, as células cancerígenas são sujeitas a gradientes de hipóxia, devido a uma vascularização ineficiente. A hipóxia exerce uma forte pressão seletiva nas células cancerígenas, estando relacionada com a progressão tumoral, metastização e resistência à quimioterapia. Na presente tese, o nosso objectivo principal foi clarificar a relevância do metabolismo da cisteína na capacidade de adaptação de células de carcinomas do ovário a condições de hipóxia e à presença de sais de platina (carboplatina), duas condições que impõem uma forte pressão seletiva nas células cancerígenas. Para isto, recorremos essencialmente a duas linhas celulares de cancro de ovário de dois tipos histológicos diferentes: uma linha de carcinoma seroso de alto grau (HG-OSC) – OVCAR3 e uma linha de carcinoma de células claras (OCCC) – ES2. É importante referir que o tipo histológico carcinoma seroso de alto grau (HGOSC) é o mais frequente, enquanto que o OCCC, apesar de menos frequente, é geralmente resistente à terapia convencional. Adicionalmente, recorremos a uma linha celular de carcinoma do ovário cujo tipo histológico é desconhecido (A2780 sensíveis/parentais e A2780 resistentes a cisplatina) e a outra linha de HG-OSC (OVCAR8). Recorremos ainda a amostras de soro de mulheres com tumores de ovário benignos e malignos, assim como a amostras de soro de mulheres saudáveis, a amostras de carcinomas de ovário de diferentes tipos histológicos e a amostras de líquido ascítico de mulheres com cancro de ovário. No primeiro capítulo de resultados experimentais começámos por investigar qual o efeito da seleção de células ES2 e OVCAR3 em condições de normóxia e em hipóxia na capacidade destas se adaptarem à carboplatina, pretendendo ainda verificar qual o papel da cisteína na resposta a estes dois ambientes hipóxia/carboplatina. Os nossos resultados mostraram que a cisteína facilita a adaptação a condições de hipóxia que, por sua vez, é capaz de induzir quimioresistência. No segundo capítulo de resultados experimentais pretendemos aprofundar o papel da cisteína na proteção de células de carcinoma do ovário em condições de hipóxia e na presença de carboplatina. Pretendemos ainda verificar se a cisteína apresenta relevância em contexto clínico, averiguando a possibilidade para o seu uso em diagnóstico e como ferramenta de prognóstico da doença. Os nossos resultados indicaram que a cisteína tem um papel protetor amplamente distribuído por diferentes linhas de cancro de ovário, tanto em condições de hipóxia, como na presença de carboplatina. Nas células ES2, os dados sugeriram que as dinâmicas de síntese e degradação de tióis estão subjacentes ao efeito protetor da cisteína em condições de hipóxia. Relativamente ao seu papel em contexto clínico, através da quantificação de tióis em soros de mulheres saudáveis e em mulheres com tumores de ovário benignos e malignos, verificámos que os níveis totais (cisteína livre e proteínas cisteinilada) conjuntamente com os níveis livre totais de cisteína foram capazes de distinguir estes três grupos de mulheres, sugerindo assim que este tiol poderá ser usado como um marcador de diagnóstico precoce da doença. Em amostras de tumores, verificámos uma tendência (não significativa) para níveis de cisteína mais altos no tipo histológico OCCC e também em HG-OSC apenas após quimioterapia, reforçando um papel importante da cisteína no tipo histológico OCCC e na aquisição de quimioresistência. Para além disto, através da análise do conteúdo de tióis em líquidos ascíticos de pacientes com carcinoma de ovário em estadios avançados da doença, verificámos ainda que a cisteína foi o tiol prevalente encontrado nesta importante fracção do microambiente tumoral, suportando um papel relevante deste tiol também na progressão da doença. No terceiro capítulo referente a dados experimentais, pretendemos clarificar o mecanismo por detrás do papel protetor da cisteína em condições de hipóxia. Assim, para além das dinâmicas de síntese e degradação de GSH, pretendemos explorar qual o papel do H2S na adaptação das células de cancro de ovário a condições de hipóxia. Os nossos resultados sugeriram um papel importante da cisteína na produção de ATP, mediado pelo sistema de transporte xc- , que requer o metabolismo da cisteína, não sendo o H2S por si suficiente para aumentar a produção de ATP em condições de hipóxia. No entanto, um papel direto da cisteína na produção de ATP é ainda incerto, uma vez que a contribuição deste tiol no metabolismo energético celular poderá ser devido a uma contribuição indireta, conduzido por um aumento dos níveis de GSH, permitindo assim um equilíbrio redox, crucial para o metabolismo celular. Através de 1H-RMN (espectroscopia por ressonância magnética nuclear) verificámos que a cisteína teve um impacto profundo no metabolismo das células ES2, permitindo uma remodelação metabólica em condições de hipóxia, o que poderá estar subjacente à adaptação destas células nestas condições. De um modo geral, este trabalho permitiu aumentar o conhecimento e conduzir a novas abordagens para o diagnóstico, prognóstico e terapia do cancro de ovário através do metabolismo da cisteína. Isto poderá permitir a implementação de novas abordagens de rastreio, diagnóstico e tratamento da doença, permitindo assim superar a quimioresistência e o mau prognósticos associados ao cancro do ovário.

ABSTRACT: Ovarian cancer is the third most common gynaecologic malignancy and the main cause of death from gynaecologic cancer. Despite in the last 30 years an improvement of the overall survival of ovarian cancer patients has been observed, an increased cure rate was not registered. The high mortality associated with ovarian cancer is mainly due to a late diagnosis and resistance to treatment, barring ovarian cancer cure. Given the lack of a specific therapy against ovarian cancer, the treatment depends essentially on the use of generalised and comprehensive cytotoxic drugs, most of them belonging to the group of alkylating/oxidative agents, as platinum salts. Chemotherapy imposes high selection pressures in cancer cells, which may affect their evolutionary trajectories, selecting the chemoresistant ones, which will continue the progression and relapse of the disease, contributing to morbidity and mortality. In recent years, cancer metabolism has acquired a central position in oncobiology, being the metabolic remodelling a requirement for tumour progression, allowing cancer cells to respond to the selective Pressures of the microenvironment, such as hypoxia and cytotoxic drugs. These selective pressures promote cell death in non-adapted cells and positively select cells that exhibit growth advantage that will further sustain cancer progression and metastasis. Endogenous metabolism also limits drugs response. A role of cysteine in cancer by contributing for H2S generation and as a precursor of the antioxidant glutathione (GSH), were already reported. GSH has a crucial role as an antioxidant and also as a detoxifying system allowing the physiological maintenance of metabolic pathways, being intimately associated with chemoresistance. H2S is involved in several biological processes, acting also as an antioxidant and being associated with cancer progression and chemoresistance. As a solid tumour grows, such as an ovarian tumour, due to inefficient vascularisation, cancer cells are exposed to regions of hypoxia, known as a boost factor for tumour progression, metastasis and resistance to therapy. The present thesis aimed to clarify the relevance of cysteine metabolism in ovarian cancer cells adaptability to both hypoxia and platinum salts (carboplatin). These stressful conditions impose strong evolutionary selection pressure on cancer cells. Our results have provided evidence that cysteine metabolism has a role in ovarian cancer cells fast response and adaptation to hypoxic conditions that, in turn, are capable of driving chemoresistance. Moreover, cysteine showed to present a widespread protective effect against both hypoxia and carboplatininduced death among ovarian cancer cell lines. Importantly, our findings were also supported in a clinical context, as an overall increase of thiols concentration was found in serum from patients with ovarian neoplasms, regardless malignancy. Strikingly, the free levels of cysteine together with protein-Scysteinylation levels were able to distinguish patients with malignant tumours from patients with benign tumours and also from healthy individuals, supporting that the levels of cysteine and protein-S-cysteinylation can be putative biomarkers for ovarian cancer early diagnosis. Cysteine was also the prevalent thiol and Scysteinylation was the most abundant form of S-thiolated proteins in the ascitic fluid from patients with advanced disease. The ascitic fluid is an important compartment of the ovarian cancer cells microenvironment, supporting a clinical relevance of cysteine also in the progression of the disease. Given the protective effect of cysteine in hypoxic ovarian cancer cells, we also aimed to address the possible mechanisms by which cysteine would be beneficial under hypoxia. Our results have supported a role of a higher thiols turnover in the adaptation to this environment, especially in ES2 cells. Moreover, results have also supported a role of cysteine in energy production mediated by the xc- system, that requires cysteine metabolism instead of H2S per se. However, the direct role of cysteine in ATP production is still uncertain as this amino acid can have an indirect contribution to ATP synthesis driven by an increased GSH content, allowing the redox equilibrium crucial for the overall cellular metabolism. Strikingly, 1H-NMR results have suggested that cysteine impacted profoundly ES2 cells metabolism under hypoxia, allowing a metabolic reprogramming, that probably underlies ES2 cells adaptation to hypoxia. Taken together, this thesis has shed light on new paths for ovarian cancer screening, diagnosis, prognosis and therapy, where cysteine metabolic profile might allow the design of new and useful approaches to fight this disease, thus overcoming its poor prognosis.