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Towards a new therapy for diabetic retinopathy: ras and berries / Daniela Filipa Jorge da Cruz Santos ; orient. Gabriela A. Silva

Main Author Santos, Daniela Filipa Jorge da Cruz Secondary Author Silva, Gabriela A. Language Inglês. Publication Lisboa : NOVA Medical School, 2021 Description xxiv, 164 p. : il. Abstract RESUMO: As doenças da retina são um conjunto de patologias que causam perdas significativas de visão ou, em estadios mais graves, cegueira. De entre este conjunto a Retinopatia Diabética (RD) é uma das mais comuns, sendo uma complicação associada à progressão da Diabetes mellitus (DM) que afeta maioritariamente adultos em idade ativa. A RD é classicamente descrita como uma complicação progressiva microvascular associada a inflamação crónica. Embora o mecanismo exato de eventos associados à patofisiologia da RD não esteja completamente descrito, acredita-se que a exposição crónica a elevados níveis de glucose (hiperglicemia) desencandeia uma cascata de alterações bioquímicas e fisiológicas que inclui danos microvasculares e alterações na barreira hemato-retiniana que levam à perda da sua integridade. Estes eventos permitem a passagem de fluído e fatores com efeito prejudicial, como citoquinas, fatores de crescimento e fatores inflamatórios, assim como a promoção de alterações na expressão de fatores que podem causar danos celulares, desenvolvimento anormal de vasos sanguíneos na retina (neovascularização), inflamação crónica e isquémia. Atualmente, existem terapias bastante eficazes para a RD, apenas aplicadas numa fase mais avançada da doença. No entanto, existe uma necessidade urgente de desenvolver alternativas que possam ser aplicadas na prevenção da progressão da RD, antes dos primeiros sinais de perda visual. Neste trabalho propomos estudar a modulação do Sistema da ReninaAngiotensina e as propriedades bioativas dos metabolitos derivados de polifenóis como possíveis abordagens terapêuticas para melhorar as alterações moleculares que levam ao desenvolvimento de RD. O Sistema da Renina-Angiotensina (SRA) é composto por um complexo número de vias, principalmente descrito pelo seu papel na regulação da pressão arterial. O SRA é expresso em diferentes tecidos, incluindo no olho, sendo responsável pelos efeitos locais e alterações a longo-prazo desses órgãos. Assim, tem vindo a ser sugerido como tendo um papel importante na patologia ocular. A literatura também descreve benefícios na ativação do eixo protetor do SRA para o tratamento de condições quePor outro lado, os polifenóis e os seus derivados têm vindo a ser intensamente estudados pelas suas propriedades anti-oxidantes e anti-inflamatórias, com grande potencial terapêutico. Metabolitos sulfatados de Catecol e Pirogalol foram encontrados recentemente e pela primeira vez em circulação no plasma de voluntários após a ingestão de um puré de frutas rico em polifenóis. A identificação destes metabolitos fenólicos leva ao desenvolvimento de uma importante área de investigação no sentido de avaliar o seu potencial, não só em situação de tratamento de doença, mas também como retardadores do seu desenvolvimento. Usando modelos celulares de retina e animais diabéticos, caracterizámos o SRA da retina e avaliámos como a sua modulação com um inibidor direto da renina (aliscireno) contribui para a melhoria da RD no que diz respeito a eventos de stress oxidativo, angiogénese e inflamação. Além disso, o efeito dos metabolitos de Catecol e Pirogalol na expressão de proteínas que estão descritas como estando envolvidas na patofisiologia da RD foi estudado, explorando o seu potencial terapêutico nestes modelos. Neste trabalho foi possível mostrar que as células do epitélio pigmentar da retina (do inglês retinal pigment epithelium, RPE) expressam os principais componentes do SRA e que este sistema foi desregulado por concentrações elevadas de glucose. A exposição das RPE a angiotensina II diminui os níveis do fator de crescimento endotelial vascular (do inglês vascular endotelial growth factor, VEGF) e aumenta simultaneamente a expressão dos componentes do eixo protetor. Adicionalmente, a presença de angiotensina II estimula a produção de espécies reativas de oxigénio nas RPE. O tratamento das RPE com o inibidor direto da renina, aliscireno, diminui a atividade da renina e, consequentemente, diminui os níveis de angiotensina II. Os níveis de stress oxidativo e expressão do fator pro-angiogénico VEGF diminuem após ação do aliscireno e, simultaneamente, a expressão do fator derivado do epitélio pigmentar (do ingês pigment epithelium-derived factor, PEDF) aumenta. Finalmente, a ativação do eixo protetor através da sobre-expressão da enzima conversora da angiotensina 2 protege as células da RPE da inflamação e stress oxidativo. Adicionalmente, a exposição das RPE ao metabolito sulfatado de pirogalol (Pyrsulf) protege as células da inflamação em determinadas condições e efetivamente diminui a expressão de VEGF em células expostas a elevadas concentrações de glucose em hipoxia. Além disso, uma única injeção intraocular de Pyr-sulf diminuiu a expressão do marcador da microglia, Iba1, e do fator pró-angiogénico VEGF na retina de animais diabéticos numa fase precoce do desenvolvimento da RD. Os nossos resultados do SRA da retina, juntamente com a demonstração de que o aliscireno efetivamente bloqueia o sistema em diferentes momentos da cascata, sugerem que este fármaco pode ser uma alternativa na prevenção dos efeitos prejudiciais que resultam da sobre-ativação do SRA na retina. Ao mesmo tempo, a ativação do eixo protetor do SRA (ACE2/Ang-(1-7)/Mas), descrito como tendo efeitos ao nível da célula que contrabalançam os observados pelo eixo ACE/AngII/AT1R, mostrase como uma abordagem promissora. O efeito do metabolito sulfatado de pirogalol (Pyrsulf), nas células RPE e na retina diabética abre uma oportunidade para continuar a explorar o efeito terapêutico destes metabolitos como anti-inflamatório na RD.
ABSTRACT: Among the group of acquired retinal diseases is Diabetic Retinopathy (DR), a Diabetes mellitus (DM) complication affecting mostly working-age adults approximately twenty years after the onset of diabetes, with a significant impact on people’s quality of life and socioeconomic consequences. DR is classically regarded as complication with progressive microvascular features affecting the retina with a chronic inflammatory background. Although the exact mechanism underlying DR pathophysiology is not yet fully understood, it is believed that chronic exposure to hyperglycemia triggers a cascade of biochemical and physiological changes that includes microvascular damage and inner brain-retinal barrier breakdown. These events allow extravasation of fluid and potentially toxic factors, including cytokines, growth factors and inflammatory factors, which might cause excitotoxic damage, vascular wall leakage, neovascularization, chronic inflammation and ischemia. Nowadays, there are a few effective treatments for DR designed to act on later stages of the disease. However, there is an urgent need to target the progression of the disease, aiming a preventive therapeutic approach that can be useful before the first signs of blindness. Here we propose to study the modulation of the Renin-Angiotensin System (RAS) and the bioactive properties of (poly)phenols-derived metabolites as possible therapeutic approaches towards DR. The RAS is composed by an intricate system of pathways, mainly involved in the regulation of the blood pressure. It is known that tissue RAS is responsible for the localized effects and long-term changes in organs, suggesting a role in the pathogenesis of ocular conditions such as DR. Literature also shows evidence supporting the enhancement of the protective axis of RAS for treatment of conditions with chronic inflammation and proliferative stages, which are known DR hallmarks. On the other hand, (poly)phenols and their derivatives have been intensively studied by their antioxidant and anti-inflammatory properties, with a putative therapeutic impact. The metabolites Catechol-O-sulfate (Cat-sulf) and Pyrogallol-O-sulfate (Pyr-sulf) were found for the first time by Santos and co-workers circulating in micromolar concentration in human plasma from volunteers after ingestion of a fruit purée. The identification of these phenolic metabolites raises an emerging and very important research area towards their role in health and disease. Using a cell model of retinal pigment epithelium cells and a diabetic mouse model, we characterized retinal RAS and evaluated how its modulation by a direct renin inhibitor, aliskiren, contributes to ameliorate the DR regarding oxidative stress, angiogenesis and inflammation. Moreover, we addressed the effect of both Catechol-O-sulfate and Pyrogallol-O-sulfate metabolites in the expression of several proteins known to have a role in DR pathophysiology, to explore their therapeutic potential. Here we show that RPE cells express the main RAS constituents and this system was deregulated by hyperglycemic glucose concentrations. Exposure of RPE cells to angiotensin II increased the levels of the main pro-angiogenic factor VEGF in a concentration-dependent manner, while increasing the expression of the protective axis components. Additionally, angiotensin II also stimulated the production of ROS in RPE cells. Treatment of RPE cells with aliskiren inhibited the activity of renin and consequently decreased the levels of angiotensin II. The levels of oxidative stress decreased after treatment and the expression of anti-angiogenic factor PEDF was promoted along with the decrease in the expression of pro-angiogenic VEGF. Finally, the overexpression of ACE2 protects RPE cells from inflammation and oxidative stress. Moreover, exposure of RPE cells to the (poly)phenol-derived metabolite Pyrogallol-O-sulfate, protect against inflammation and effectively decrease the expression of VEGF in cells under high glucose and hypoxia. Additionally, a single intraocular injection of Pyrogallol-O-sulfate was able to decrease the expression of the microglial marker Iba1 and pro-angiogenic VEGF in the diabetic retina earlier in the disease progression. Our findings of the RPE RAS, together with the demonstration that aliskiren effectively blocks this system at different steps of the cascade, suggest that aliskiren might be an alternative drug for preventing the deleterious effects derived from the overactivation of the RAS. At the same time, the activation of the ACE2/Ang-(1- 7)/Mas axis, known to counterbalance the deleterious effects of ACE/AngII/AT1R axis, presents itself as a promising gene therapy approach. The effect of Pyrogallol-O-sulfate in RPE cells and diabetic retina opens an opportunity to further explore this metabolite as a therapeutic approach towards inflammation in DR.
Topical name Diabetic Retinopathy
Academic Dissertation
Index terms Tese de Doutoramento
Mecanismos de Doença e Medicina Regenerativa
Universidade NOVA de Lisboa
NOVA Medical School
2021
Online Resources Click here to access the eletronic resource http://hdl.handle.net/10362/115960
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Holdings
Item type Current location Call number url Status Date due Barcode
Documento Eletrónico Biblioteca NMS|FCM
online
RUN http://hdl.handle.net/10362/115960 Presencial/Restrito 20210174

RESUMO: As doenças da retina são um conjunto de patologias que causam perdas significativas de visão ou, em estadios mais graves, cegueira. De entre este conjunto a Retinopatia Diabética (RD) é uma das mais comuns, sendo uma complicação associada à progressão da Diabetes mellitus (DM) que afeta maioritariamente adultos em idade ativa. A RD é classicamente descrita como uma complicação progressiva microvascular associada a inflamação crónica. Embora o mecanismo exato de eventos associados à patofisiologia da RD não esteja completamente descrito, acredita-se que a exposição crónica a elevados níveis de glucose (hiperglicemia) desencandeia uma cascata de alterações bioquímicas e fisiológicas que inclui danos microvasculares e alterações na barreira hemato-retiniana que levam à perda da sua integridade. Estes eventos permitem a passagem de fluído e fatores com efeito prejudicial, como citoquinas, fatores de crescimento e fatores inflamatórios, assim como a promoção de alterações na expressão de fatores que podem causar danos celulares, desenvolvimento anormal de vasos sanguíneos na retina (neovascularização), inflamação crónica e isquémia. Atualmente, existem terapias bastante eficazes para a RD, apenas aplicadas numa fase mais avançada da doença. No entanto, existe uma necessidade urgente de desenvolver alternativas que possam ser aplicadas na prevenção da progressão da RD, antes dos primeiros sinais de perda visual. Neste trabalho propomos estudar a modulação do Sistema da ReninaAngiotensina e as propriedades bioativas dos metabolitos derivados de polifenóis como possíveis abordagens terapêuticas para melhorar as alterações moleculares que levam ao desenvolvimento de RD. O Sistema da Renina-Angiotensina (SRA) é composto por um complexo número de vias, principalmente descrito pelo seu papel na regulação da pressão arterial. O SRA é expresso em diferentes tecidos, incluindo no olho, sendo responsável pelos efeitos locais e alterações a longo-prazo desses órgãos. Assim, tem vindo a ser sugerido como tendo um papel importante na patologia ocular. A literatura também descreve benefícios na ativação do eixo protetor do SRA para o tratamento de condições quePor outro lado, os polifenóis e os seus derivados têm vindo a ser intensamente estudados pelas suas propriedades anti-oxidantes e anti-inflamatórias, com grande potencial terapêutico. Metabolitos sulfatados de Catecol e Pirogalol foram encontrados recentemente e pela primeira vez em circulação no plasma de voluntários após a ingestão de um puré de frutas rico em polifenóis. A identificação destes metabolitos fenólicos leva ao desenvolvimento de uma importante área de investigação no sentido de avaliar o seu potencial, não só em situação de tratamento de doença, mas também como retardadores do seu desenvolvimento. Usando modelos celulares de retina e animais diabéticos, caracterizámos o SRA da retina e avaliámos como a sua modulação com um inibidor direto da renina (aliscireno) contribui para a melhoria da RD no que diz respeito a eventos de stress oxidativo, angiogénese e inflamação. Além disso, o efeito dos metabolitos de Catecol e Pirogalol na expressão de proteínas que estão descritas como estando envolvidas na patofisiologia da RD foi estudado, explorando o seu potencial terapêutico nestes modelos. Neste trabalho foi possível mostrar que as células do epitélio pigmentar da retina (do inglês retinal pigment epithelium, RPE) expressam os principais componentes do SRA e que este sistema foi desregulado por concentrações elevadas de glucose. A exposição das RPE a angiotensina II diminui os níveis do fator de crescimento endotelial vascular (do inglês vascular endotelial growth factor, VEGF) e aumenta simultaneamente a expressão dos componentes do eixo protetor. Adicionalmente, a presença de angiotensina II estimula a produção de espécies reativas de oxigénio nas RPE. O tratamento das RPE com o inibidor direto da renina, aliscireno, diminui a atividade da renina e, consequentemente, diminui os níveis de angiotensina II. Os níveis de stress oxidativo e expressão do fator pro-angiogénico VEGF diminuem após ação do aliscireno e, simultaneamente, a expressão do fator derivado do epitélio pigmentar (do ingês pigment epithelium-derived factor, PEDF) aumenta. Finalmente, a ativação do eixo protetor através da sobre-expressão da enzima conversora da angiotensina 2 protege as células da RPE da inflamação e stress oxidativo. Adicionalmente, a exposição das RPE ao metabolito sulfatado de pirogalol (Pyrsulf) protege as células da inflamação em determinadas condições e efetivamente diminui a expressão de VEGF em células expostas a elevadas concentrações de glucose em hipoxia. Além disso, uma única injeção intraocular de Pyr-sulf diminuiu a expressão do marcador da microglia, Iba1, e do fator pró-angiogénico VEGF na retina de animais diabéticos numa fase precoce do desenvolvimento da RD. Os nossos resultados do SRA da retina, juntamente com a demonstração de que o aliscireno efetivamente bloqueia o sistema em diferentes momentos da cascata, sugerem que este fármaco pode ser uma alternativa na prevenção dos efeitos prejudiciais que resultam da sobre-ativação do SRA na retina. Ao mesmo tempo, a ativação do eixo protetor do SRA (ACE2/Ang-(1-7)/Mas), descrito como tendo efeitos ao nível da célula que contrabalançam os observados pelo eixo ACE/AngII/AT1R, mostrase como uma abordagem promissora. O efeito do metabolito sulfatado de pirogalol (Pyrsulf), nas células RPE e na retina diabética abre uma oportunidade para continuar a explorar o efeito terapêutico destes metabolitos como anti-inflamatório na RD.

ABSTRACT: Among the group of acquired retinal diseases is Diabetic Retinopathy (DR), a Diabetes mellitus (DM) complication affecting mostly working-age adults approximately twenty years after the onset of diabetes, with a significant impact on people’s quality of life and socioeconomic consequences. DR is classically regarded as complication with progressive microvascular features affecting the retina with a chronic inflammatory background. Although the exact mechanism underlying DR pathophysiology is not yet fully understood, it is believed that chronic exposure to hyperglycemia triggers a cascade of biochemical and physiological changes that includes microvascular damage and inner brain-retinal barrier breakdown. These events allow extravasation of fluid and potentially toxic factors, including cytokines, growth factors and inflammatory factors, which might cause excitotoxic damage, vascular wall leakage, neovascularization, chronic inflammation and ischemia. Nowadays, there are a few effective treatments for DR designed to act on later stages of the disease. However, there is an urgent need to target the progression of the disease, aiming a preventive therapeutic approach that can be useful before the first signs of blindness. Here we propose to study the modulation of the Renin-Angiotensin System (RAS) and the bioactive properties of (poly)phenols-derived metabolites as possible therapeutic approaches towards DR. The RAS is composed by an intricate system of pathways, mainly involved in the regulation of the blood pressure. It is known that tissue RAS is responsible for the localized effects and long-term changes in organs, suggesting a role in the pathogenesis of ocular conditions such as DR. Literature also shows evidence supporting the enhancement of the protective axis of RAS for treatment of conditions with chronic inflammation and proliferative stages, which are known DR hallmarks. On the other hand, (poly)phenols and their derivatives have been intensively studied by their antioxidant and anti-inflammatory properties, with a putative therapeutic impact. The metabolites Catechol-O-sulfate (Cat-sulf) and Pyrogallol-O-sulfate (Pyr-sulf) were found for the first time by Santos and co-workers circulating in micromolar concentration in human plasma from volunteers after ingestion of a fruit purée. The identification of these phenolic metabolites raises an emerging and very important research area towards their role in health and disease. Using a cell model of retinal pigment epithelium cells and a diabetic mouse model, we characterized retinal RAS and evaluated how its modulation by a direct renin inhibitor, aliskiren, contributes to ameliorate the DR regarding oxidative stress, angiogenesis and inflammation. Moreover, we addressed the effect of both Catechol-O-sulfate and Pyrogallol-O-sulfate metabolites in the expression of several proteins known to have a role in DR pathophysiology, to explore their therapeutic potential. Here we show that RPE cells express the main RAS constituents and this system was deregulated by hyperglycemic glucose concentrations. Exposure of RPE cells to angiotensin II increased the levels of the main pro-angiogenic factor VEGF in a concentration-dependent manner, while increasing the expression of the protective axis components. Additionally, angiotensin II also stimulated the production of ROS in RPE cells. Treatment of RPE cells with aliskiren inhibited the activity of renin and consequently decreased the levels of angiotensin II. The levels of oxidative stress decreased after treatment and the expression of anti-angiogenic factor PEDF was promoted along with the decrease in the expression of pro-angiogenic VEGF. Finally, the overexpression of ACE2 protects RPE cells from inflammation and oxidative stress. Moreover, exposure of RPE cells to the (poly)phenol-derived metabolite Pyrogallol-O-sulfate, protect against inflammation and effectively decrease the expression of VEGF in cells under high glucose and hypoxia. Additionally, a single intraocular injection of Pyrogallol-O-sulfate was able to decrease the expression of the microglial marker Iba1 and pro-angiogenic VEGF in the diabetic retina earlier in the disease progression. Our findings of the RPE RAS, together with the demonstration that aliskiren effectively blocks this system at different steps of the cascade, suggest that aliskiren might be an alternative drug for preventing the deleterious effects derived from the overactivation of the RAS. At the same time, the activation of the ACE2/Ang-(1- 7)/Mas axis, known to counterbalance the deleterious effects of ACE/AngII/AT1R axis, presents itself as a promising gene therapy approach. The effect of Pyrogallol-O-sulfate in RPE cells and diabetic retina opens an opportunity to further explore this metabolite as a therapeutic approach towards inflammation in DR.

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