RESUMO: A ocorrência de neoplasias malignas é considerada um dos principais problemas de saúde pública ao nível mundial, sendo a segunda causa de morte em países desenvolvidos. Nos últimos 10 anos, os avanços na terapêutica utilizada no tratamento do cancro veio aumentar a taxa de sobrevivência dos doentes oncológicos. Infelizmente, a doença metastática é ainda a principal responsável pela mortalidade e morbilidade associadas à doença. Em 2000, Hanahan e Weinberg publicaram a sistematização das principais características da transformação maligna em seis categorias: autossuficiência para a produção de sinais ativadores da proliferação celular, insensibilidade para fatores inibidores da proliferação, capacidade replicativa ilimitada, capacidade de estimulação da angiogénese, capacidade de bloquear mecanismos desencadeadores de processos de morte celular e capacidade de invasão dos tecidos e de metastização noutros órgãos. Uma década mais tarde, surgiram duas novas categorias que vieram a revelar-se essenciais para a progressão tumoral, a reprogramação metabólica das células tumorais e a capacidade de evasão à ação do sistema imunitário. Durante a progressão tumoral, a formação de novos vasos sanguíneos é essencial para a oxigenação e suplementação de nutrientes às células tumorais, que consequentemente impulsiona a sobrevivência das células malignas e o crescimento tumoral, bem como o processo de metastização. Estudos na área da angiogénese tumoral demonstraram que contrariamente ao que acontece com os vasos sanguíneos normais, os vasos tumorais são frágeis e permeáveis, o que por sua vez favorece a extravasão de células tumorais para a corrente sanguínea e posteriormente a metastização, além de comprometer a entrega dos agentes quimioterápicos. Nos últimos anos, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas anti-angiogénicas tem vindo a revelar uma baixa eficácia no tratamento de doentes oncológicos, sugerindo que os mecanismos subjacentes à angiogénese tumoral ainda não são totalmente conhecidos. Para além disso, os novos estudos indicam que estratégias que normalizam a vasculatura tumoral, em vez de a destruir, facilitam a chegada dos fármacos ao tumor, aumentando assim a sua eficácia. É de salientar ainda que a contribuição de células progenitoras endoteliais (EPCs) para o sucesso da angiogénese tumoral tem sido desvalorizada, em parte devido à inexistência de marcadores específicos que leva à má caracterização dessas células, o que impede e identificação de subtipos celulares que atuam como EPCs. Durante a tumorigénese, a remodelação metabólica das células tumorais promove a geração de um microambiente pró-oxidante que atua como um estímulo proangiogénico responsável pela ativação das células endoteliais (ECs), que se traduz na passagem das ECs de um estado de quiescência para uma fase proliferativa. O microambiente tumoral pró-oxidante também afeta mecanismos que atuam nas células malignas, tais como a ferroptose que tem como mecanismo subjacente a formação de peróxidos lipídicos devido à acumulação de espécies-reativas de oxigénio (ROS). Embora este processo tenha sido inicialmente descrito como um mecanismo de morte celular dependente de ferro, atualmente já é assumido também como responsável pela regulação de processos biológicos e fisiopatológicos. Ao nível molecular a ferroptose pode ser ativada pela angiopoietina 4 (ANGPTL4), uma molécula a jusante da via TAZANGPTL4-NOX2. Por sua vez, a ativação desta via induz ferroptose através da geração de radicais superóxidos. Além da sua relevância na promoção da ferroptose, a ANGPTL4 também é um conhecido estimulador da angiogénese, o que sugere uma conexão entre o a ferroptose e a angiogénese. Nos últimos anos, o b-bloqueador não seletivo Propranolol que é frequentemente prescrito para o tratamento de doenças cardiovasculares, hipertensão e enxaquecas, foi adaptado para o tratamento de tumores vasculares, como hemangiomas e cavernomas. Ao nível molecular sabe-se que o Propranolol tem a capacidade de interferir com a angiogénese através da diminuição dos níveis do fator de crescimento vascular (VEGF) e do fator de crescimento de fibroblasto (FGF). Recentemente, o Propranolol foi descrito como inibidor da ANGPTL4 em células de hemangioma e como tendo a capacidade inibitória da ferroptose. Porém, atualmente ainda é desconhecido o mecanismo exato pelo qual o Propranolol atua nas ECs e afeta a angiogénese. Alguns estudos retrospetivos em doentes com carcinoma da mama demonstram que a administração de Propranolol para outros fins terapêuticos correlacionam-se com um melhor prognóstico da doença oncológica. Os efeitos anti-angiogénicos do Propranolol em tumores vasculares, aliado aos estudos retrospetivos em doentes oncológicos, levam-nos a acreditar que o benefício da aplicação do Propranolol no tratamento do cancro poderá estar relacionado com a sua interferência com a angiogénese. Os avanços ao nível dos tratamentos na área da oncologia têm vindo a aumentar a sobrevida dos doentes, porém, o uso destas terapêuticas está associado a toxicidade aguda e crónica. As novas evidências demonstram que a utilização de terapêuticas dirigidas às células tumorais poderão aumentar a especificidade dos tratamentos, diminuindo a toxicidade em células normais. Com os avanços científicos, o desenvolvimento de estratégias focadas em promover simultaneamente a morte celular de células tumorais e a normalização da vasculatura permitirá um aumento da eficácia do tratamento e uma diminuição dos efeitos adversos. Na presente tese, o principal objetivo é investigar se os monócitos podem atuar como EPCs e se o stress oxidativo promove a ativação das ECs através de um mecanismo semelhante à ferroptose, que poderá ser revertido pela ação anti-angiogénica do Propranolol. Assim, para avaliar a capacidade dos monócitos em diferenciar em ECs utilizámos monócitos isolados a partir de sangue periférico de dadores de sangue saudáveis e para e o estudo do mecanismo subjacente à ação do Propranolol e da ferroptose utilizámos ECs isoladas da veia do cordão umbilical humano (HUVECs) que foram expostas a Erastina, um ativador da ferroptose, na ausência e na presença de Propranolol. No 1º capítulo de resultados experimentais desta tese foi demonstrado, em vários contextos biológicos, que os monócitos expostos a um estímulo pro-angiogénico diferenciam em ECs e incorporam os vasos sanguíneos. A angiogénese tumoral foi um dos fenómenos explorados que provou a capacidade de incorporação dos monócitos nos vasos e comprovou-se também que as ROS é um estímulo que promove a diferenciação de monócitos em ECs. No 2º capítulo de resultados foi verificado que o Propranolol inibe as propriedades angiogénicas das ECs, como a proliferação, migração e capacidade in vitro e ex vivo de formar estruturas que mimetizam vasos sanguíneos in vivo. Numa criança com cavernomas cerebrais, também é responsável pela diminuição dos níveis de células do sangue que apresentam em simultâneo marcadores de monócitos e de ECs (CD14+ /CD31+) e os níveis de VEGF no soro de sangue periférico. Estes resultados sugerem que o Propranolol inibe a ativação de ECs e a mobilização de célulasCD14+/CD31+ que promovem a expansão dos cavernomas cerebrais. No 3º capítulo foi demonstrado que para além do efeito conhecido das ROS na promoção da angiogénese, a ativação não letal da ferroptose pela geração de peróxidos lipídicos, induzidos pela exposição à Erastina, também contribui para a ativação de ECs, com promoção da proliferação, da migração e da formação de estruturas semelhantes a vasos. Durante este processo existe um aumento das ROS, depleção do glutatião (GSH), inibição da importação de cist(e)ína e a acumulação de peróxidos lipídicos, que contribuem para a ferroptose. Além disso, a exposição de ECs a Erastina promove um aumento de lacunas nas junções aderentes da caderina endotelial vascular (VE-Cad) e a adesão de células cancerígenas ao endotélio pelo aumento da expressão de selectinas (ICAM e VCAM), favorecendo também a migração transendotelial de células cancerígenas. A ativação da ferroptose em ECs mimetiza as características dos vasos tumorais, indicando que este mecanismo também pode promover a angiogénese tumoral. Ainda neste contexto, observou-se que as propriedades antioxidantes e antiangiogénicas do Propranolol mediadas pela produção de sulfureto de hidrogénio (H2S) revertem o efeito do mecanismo semelhante à ferroptose na ativação de ECs, reforçando a sua utilidade como fármaco anti-angiogénico. Por um lado, foi provado que o Propranolol tem a capacidade de inibir a ativação de ECs e a formação de estruturas que mimetizam vasos, características estas potenciadas pelo mecanismo semelhante à ferroptose. Por outro lado, o Propranolol induz a normalização das estruturas vasculares já formadas, eventualmente favorecendo uma maior eficiência na distribuição de agentes quimioterápicos. No 4º capítulo de resultados, foi explorada uma estratégia terapêutica utilizando as propriedades antioxidantes do Propranolol seletivas para ECs juntamente com a utilização de nanopartículas dendriméricas que encapsuladas com seleno-crisina (SeChry@PUREG4) com propriedades oxidantes. Esta estratégia promoveu a geração de stress oxidativo e consequente morte das células cancerígenas, enquanto que nas ECs o efeito protetor do Propranolol reverteu a geração de ROS e a permeabilidade das estruturas endoteliais pela diminuição de lacunas nas junções aderentes de VE-cad. De um modo geral este projeto permitiu expandir o conhecimento dos mecanismos envolvidos no controlo da angiogénese tumoral e desvendou a contribuição dos monócitos como EPCs, bem como a sua contribuição para formação da vasculatura tumoral. Além disso, foi reforçada a utilização do Propranolol como um fármaco antiangiogénico e a sua combinação com SeChry@PUREG4 no contexto de uma nova estratégia terapêutica duplamente dirigida às células malignas e às ECs

ABSTRACT: Cancer is one of the most burden diseases worldwide and every year millions of people around the world are diagnosed and eventually die from it. In the past 10 years, an increment in the efficacy of cancer treatment reduced the overall mortality from cancer. However, the metastatic disease and resistance to treatments are still largely responsible for cancer patients mortality and morbidity. Advances in cancer research have shed a light on the biology of cancer, pointing out that it cannot be studied only from a cancer cell point of view but the involvement of other non-cancerous cells during tumorigenesis should also be considered. For example, the contribution of endothelial cells (ECs) underlying tumor angiogenesis has revealed to be pivotal for cancer cell survival, tumor growth and metastatic spread. The formation of tumor neovessels, supporting the delivery of oxygen and nutrients to the tumor is prompted by the generation of a pro-angiogenic and a pro-oxidant tumor microenvironment (TME). However, contrarily to normal vessels, the tumor vasculature is composed by a fragile and permeable vascular network, that enables cancer cell intravasation, tumor metastasis and compromises the delivery of chemotherapeutic agents and consequently their efficacy. For the past years, the development of strategies using anti-angiogenic drugs has tried to hinder tumor growth by disrupting the blood supply to tumors. However, recent evidence shows that instead of destroying tumor neovessels, the restoration of its normalization would increase the penetration of therapeutic agents to the tumor, improving their efficacy. Those evidence allied to the fact that the clinical results of anti-angiogenic agents have been disappointing, indicates that the mechanisms underlying tumor angiogenesis remain to be fully understood. For instance, the contribution of endothelial progenitor cells (EPCs) to tumor angiogenesis may be undervalued in part because, so far, the absence of specific markers to characterize EPCs may lead to the underestimated capacity of other cell subtypes in acting as EPCs. As mentioned above, the pro-oxidant TME is known as an active player in the activation of the angiogenic switch. Furthermore, the role of reactive oxygen species (ROS)-dependent mechanisms, such as ferroptosis, recently described as a promoter of cellular phenomena beyond cell death; on the regulation of angiogenesis has not been explored so far. Propranolol, a b-blocker, has shown efficacy in the treatment of vascular tumors, as hemangiomas and cavernomas although, the precise mechanism(s) by which it interferes with angiogenesis remains to be clarified. Recently, Propranolol has been pointed out has having anti-ferroptotic properties and its use correlates with better prognosis of cancer patients and fewer metastasis. The present thesis proposed to clarify that monocytes can act as EPCs and that a ferroptosis-like mechanism sustains the EC activation and further angiogenic switch, being possibly reverted by the anti-angiogenic effect of Propranolol. We disclosed that monocytes are EPCs that upon a pro-angiogenic stimuli, differentiate into ECs and incorporate blood vessels. In a cancer scenario, monocytes contribute to cancer progression, in part by promoting the formation of the tumor neovasculature. As mentioned, and since the generation of a pro-oxidant TME favors angiogenesis, herein we observed that ROS push monocytes to differentiate into ECs, which in turn favor tumor neovasculature formation. The potential of translation of these data into the clinical context can be supported by the effect of Propranolol administration in a child with cerebral cavernous malformation (CCM). In fact, Propranolol administration decreased the levels of circulating cells expressing monocytic and ECs markers (CD14+ /CD31+ ), and VEGF levels in the peripheral blood, indicating that Propranolol impairs the recruitment of CD14+ /CD31+ monocytes to the vascular lesion. In addition to the already described relevance of ROS in the promotion of angiogenesis, we describe that ROS-induced lipid peroxides generation induced by Erastin, at a non-lethal level, promotes ECs proliferation and migration and accounts for vessel-like structures formation. The stimulation of these ECs features where accompanied by ferroptosis hallmarks, which includes increased ROS generation, glutathione (GSH) depletion, abrogation of cyst(e)ine import and lipid peroxides accumulation. These alterations were accompanied by the generation of a leakier ECs monolayer, presenting increased intercellular junctional gaps in VE-Cadherin (VE-Cad) adherens junctions that facilitates the transendothelial cancer cells migration. The increased levels of selectins (ICAM and VCAM) were also observed, promoting cancer cells adhesion to ECs. The antioxidant and anti-ferroptotic Propranolol properties, mediated by the generation of hydrogen sulfide (H2S), reverted the Erastin-induced ECs hyperactivation. Interestingly, since we observed that the antioxidant properties of Propranolol mediated by H2S generation are EC-specific, we unraveled a putative antitumor and anti-angiogenic strategy using the pro-oxidant dendrimeric nanoparticles loaded with selenium chrysin (SeChry@PUREG4) in combination with Propranolol. This strategy allowed the increase in oxidative stress induced-cancer cells death, potentiated by the action of Propranolol, while its protective effect in ECs avoided the generation of oxidative stress, which in turn impairs the generation of a leakier vascular structure and cancer cells extravasation. Together, our results indicate that monocytes are EPCs that contribute to tumor angiogenesis and that a ferroptosis-like mechanism promotes the hyperactivation of ECs and the angiogenic switch with leakier vessel-like structures, which recapitulates the formation of the unstable tumor neovasculature that favors cancer cell’s dissemination and metastasis. Moreover, a new therapeutic strategy was proposed, joining the antiangiogenic and anti-tumor effects of Propranolol and the pro-oxidant effect of SeChry@PUREG4, tackling cancer cells and stabilizing tumor neovessels, in order to impair metastasis and improve drug delivery.