RESUMO: A reprogramação direta de células somáticas em neurónios é uma estratégia promissora para a reparação de danos cerebrais. Esta técnica já foi concretizada in vivo, em glia adulta reativa e pós-natal do córtex, através da expressão forçada de fatores de reprogramação introduzidos por vetores virais. No entanto, ainda existem limitações a ultrapassar para que esta técnica possa ser utilizada como uma terapia eficaz e segura. Este projeto pretende investigar o efeito da injeção de vírus no córtex pós-natal e adulto lesionado, pois estudos recentes sugerem que os vetores virais incitam respostas inflamatórias, que podem influenciar o resultado da reprogramação celular. Como tal, examinámos a ativação da glia e a resposta imune desencadeada pelos vetores virais mais utilizados em reprogramação neuronal (retrovírus, lentivírus e vírus adeno-associado) no córtex pós-natal e o efeito do retrovírus no córtex lesionado adulto. O nosso grupo investigou o potencial de reprogramação do fator neurogénico Ascl1 e descobriu que o seu mutante Ascl1SA6, quando combinado com a molécula Bcl2, aumenta a eficácia da reprogramação neuronal direta e facilita a especificação dos neurónios induzidos. Assim, de seguida foi avaliada a eficácia da reprogramação, maturação e sobrevivência dos neurónios induzidos com Ascl1SA6 ou Ascl1. Para isso, a coexpressão foi otimizada no córtex pós-natal. De seguida, a capacidade do mutante Ascl1SA6 converter glia in vivo foi avaliada no córtex lesionado adulto. Por fim, examinámos a sobrevivência a longo prazo dos neurónios induzidos com a expressão de Ascl1SA6 e Bcl2. Neste trabalho expomos que os vetores virais mais utilizados em reprogramação celular provocam a ativação da glia e incitam uma resposta imune no córtex pós-natal, sobretudo o lentivírus. No córtex adulto, a injeção com o retrovírus agrava a resposta inflamatória que acompanha a lesão. Relativamente ao segundo objetivo, observámos que a coexpressão de Ascl1SA6 e Bcl2 com um único vetor diminuiu a eficácia da reprogramação comparado com o uso de vários vetores. De seguida, que o mutante Ascl1SA6 induz a conversão neuronal, mas com pouca eficiência e finalmente, que a sobrevivência dos neurónios induzidos por Ascl1SA6 e Bcl2 a longo prazo é limitada. Em conclusão, este estudo sugeriu o impacto dos vetores virais na conversão neuronal e forneceu mais informação sobre o potencial de reprogramação do mutante Ascl1SA6 e as limitações na sobrevivência a longo prazo dos neurónios induzidos.

ABSTRACT: Direct neuronal reprogramming, whereby non-neuronal cells are instructed to acquire a neuronal identity, is a promising brain repair strategy. It has been achieved in vivo by targeting adult reactive and postnatal cortical glia with a viral-mediated delivery and forced expression of reprogramming factors. Nevertheless, there are still limitations to overcome towards an efficient and safe clinical translation. Reports suggest that viral vectors induce an inflammatory response, possibly impacting the reprogramming outcome. Henceforth, we aimed to assess the effect of viral injection in the postnatal non-lesioned cortex and adult lesioned cortex. Namely, glial activation and immune response triggered by commonly used vectors (adenoassociated virus, retrovirus, and lentivirus) in the postnatal non-lesioned cortex and by retrovirus in the adult lesioned cortex. Our group has investigated the reprogramming potential of the proneural factor Ascl1 and discovered that a phosphodeficient Ascl1 mutant (Ascl1SA6), combined with Bcl2, has increased reprogramming efficiency and promotes neuronal specification of induced neurons. Thus, the second aim was to evaluate further the neuronal efficiency, maturation, and survival with Ascl1SA6 or Ascl1. For this, we optimized the coexpression of the factors and Bcl2 in the postnatal cortex. Next, we analyzed whether Ascl1SA6 alone enables in vivo neuronal conversion in the adult lesioned cortex. Finally, we assessed the long-term maturation and survival of induced neurons generated by the co-expression of Ascl1SA6 and Bcl2. Here we showed that the most commonly used viral vectors in neuronal reprogramming triggered glial activation and immune infiltration in the postnatal intact cerebral cortex, especially the lentivirus vector. Furthermore, in the adult lesioned cortex, the retrovirus vector aggravated the lesion-induced environment. Regarding our second aim, the co-transduction of Ascl1SA6 and Bcl2 with a single vector (polycistronic) resulted in lower reprogramming efficiency than a co-injection of a viral mixture. We also discovered that the forced expression of Ascl1SA6 alone induced neuronal conversion but not efficiently. Finally, our results showed that the long-term survival of the iNs generated with Ascl1SA6 and Bcl2 is very limited. In conclusion, our study suggested the impact of a virus-mediated delivery of reprogramming factors in the local in vivo environment and the reprogramming outcome. Additionally, it provided further comprehension of the reprogramming potential of Ascl1SA6 and revealed current limitations in the long-term survival of induced neurons.