RESUMO: A capacidade de manipular geneticamente um único tipo de célula numa mistura complexa de células, tal como no corpo humano, tem um enorme potencial terapêutico e de diagnóstico. Contudo, actualmente, a geração sistemática de dispositivos para a entrega de mensagens geneticamente codificadas a tipos celulares específicos dentro de organismos complexos não é possível. Uma das razões para esta limitação é a escassez de elementos reguladores específicos para tipos celulares e com capacidade de condução de genes, como por exemplo, “enhancers”. Testes empíricos utilizando um atlas de actividade de elementos reguladores humanos demonstraram que a maioria das células não possuem “enhancers” específicos. Estes mesmos testes mostram que as abordagens de genética interseccional através do uso de uma combinação de elementos reguladores podem aumentar a suscetibilidade das células de serem alvo de terapias genéticas personalizadas. Isto levou ao conceito “Versatile Entry Codes” (ou VEnCodes), que são as mais pequenas intersecções de elementos reguladores co-ativados que conferem valor de diagnóstico para distinguir entre a célula alvo e outros tipos de células não alvo dentro de uma mistura complexa de células. A aplicação prática dos VEnCodes requer a implementação de métodos de genética interseccional, tais como a montagem de proteínas fragmentadas ou a ativação de genes mediados por recombinases. Em geral, estes circuitos genéticos traduzem as múltiplas entradas da actividade dos “enhancers” num único resultado genético. Neste trabalho, tentamos gerar um biosensor genético para células humanas estaminais induzidas pluripotentes (hiPSCs), desenvolvendo uma estratégia de proteína fragmentada como método interseccional e acoplando-a aos VEnCodes para hiPSCs obtidos através de diferentes métodos. Primeiro, gerámos uma versão funcional do ativador transcricional dependente da tetraciclina inversa (rtTAv), utilizando uma combinação de três inteínas ortogonais, NpuDnaE, gp41-1, e NrdJ-1. Validámos então, em duas linhas hiPSC (IMR90-4 e Nelson), a actividade dos “enhancers” para células estaminais pluripotentes (OCT4, SOX2 e Nanog), assim como um “enhancer” por nós identificado através da exploração de dados de epigenómica publicamente acessíveis, o “enhancer” putativo de células estaminais localizado no cromossoma 2 (pSCE2). Validamos também as intersecções destes “enhancers” utilizando as versões do rtTAv divididas em 2x- e 3x. Estas intersecções foram então validadas como especificas para hiPSCs testando-as na linha não-iPSC, HeLa. Utilizámos também algoritmos xiv desenvolvidos no nosso laboratório para gerar VEnCodes para hiPSCs, baseados num subconjunto de dados de sequenciamento “Cap Analysis Gene Expression” (CAGE-seq) disponíveis publicamente (consórcio FANTOM5). Identificámos e validámos 12 “enhancers” para hiPSCs, que podem ser utilizados em estratégias baseadas em VEnCodes. Esperamos que a técnica VEnCode seja útil para superar as limitações impostas pelas atuais terapias genéticas e técnicas de modificação genética, permitindo um aumento na especificidade e sensibilidade na entrega de terapias genéticas.

ABSTRACT: The ability to genetically manipulate a single cell type in a complex mixture of cells such as in the human body carries enormous therapeutic and diagnostic potential. However, at present, the systematic generation of devices for the delivery of genetically encoded messages to specific cell types within complex organisms is not possible. One of the reasons for this limitation is the paucity of true cell-type specific regulatory elements with gene driving capacity, e.g., enhancers. Empirical tests using a human regulatory element activity atlas have demonstrated that most cells do not have reliable cell-type specific enhancers. These same tests show that intersectional genetics approaches using just a handful of regulatory elements can increase the breadth and robustness of the cells that are amenable to specific genetic targeting. This has led to the concept of Versatile Entry Codes (VEnCodes), which are the smallest intersections of co-activated regulatory elements that confer diagnostic value to distinguish between the target cell and other non-target cell types within a complex mixture of cells. Practical application of VEnCodes require the implementation of intersectional genetic methods, such as split-protein assembly or recombinase-mediated gene activation. In general, these gene circuits translate the multiple enhancer activity inputs into a single genetic output. Here, we attempted to generate a genetic biosensor for human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs), by developing a split-protein strategy as intersectional method and coupling it to hiPSCs VEnCodes obtained using different methods. We first generated a functional split version of the reverse tetracycline dependent transcriptional activator (rtTAv) by using a combination of three orthogonal split inteins NpuDnaE, gp41-1, and NrdJ-1. We then validated, in two hiPSC lines (IMR90-4 and Nelson), the activity of known pluripotent stem cell enhancers (OCT4, SOX2, and Nanog) as well as an enhancer identified by us by mining publicly available epigenomics data, putative Stem Cells Enhancer on Chromosome 2 (pSCE2) and their intersections using our custom 2x- and 3x-split-rtTAv. We found several functional intersections, which were then validated for hiPSC specificity by testing them in the non-iPSC line, HeLa. We then used VEnCode algorithms developed in our laboratory to generate hiPSC VEnCodes based on a curated-subset of publicly available Cap Analysis Gene Expression sequencing (CAGE-seq) data (FANTOM5 consortium). We identified and validated further 12 hiPSC enhancers, which can be used in VEnCode-based strategies. We hope that the VEnCode technique will be useful to overcome the limitations imposed by current gene therapies and genetic modification techniques, by allowing specificity and sensitivity in genetic delivery.