RESUMO: O Acidente Vascular Cerebral (AVC) é uma das maiores causas de mortalidade e morbidade, ligada a dano cerebral, em todo o mundo. O AVC isquémico ocorre quando a circulação sanguínea é interrompida, reduzindo os níveis de oxigénio e nutrientes no tecido cerebral. Após o restabelecimento da corrente sanguínea, o tecido volta a sofrer dano, devido ao aumento do stress oxidativo. Esta patologia é caracterizada pela presença de stress oxidativo, inflamação excessiva, excitotoxicidade e, por fim, morte celular. Apesar de existirem terapias disponíveis, estas terapias não estão focadas no tratamento do tecido cerebral e apresentam limitações ao nível da sua eficácia e no curto espaço de tempo em que a sua aplicação é eficiente. Desta forma, o desenvolvimento de novos tratamentos para a isquemia cerebral é necessário e urgente. Esta tese pretende se focar nas células da glia, de forma a promover a proteção cerebral, limitando a neuro-inflamação e a morte celular. Disfunções do sistema nervoso central (SNC) são comummente consideradas como um problema neuronal. No entanto, as células da glia estão envolvidas na resposta ao stress e a mecanismos de neuroprotecção; a prevenção da disfunção glial protege o tecido cerebral, em última análise, contribui para a recuperação do paciente. As células da glia, como por exemplo os astrócitos e a microglia, representam a maioria das células presente no cérebro. Estas células são cruciais para a homeostase cerebral, tendo importantes funções no desenvolvimento e plasticidade sináptica, na resposta inflamatória, suporte metabólico e sobrevivência neuronal. Os astrócitos têm importantes funções na modulação e maturação sináptica, suporte metabólico e proteção neuronal contra stress oxidativo e excitotoxicidade. Uma vez que estão em contante fiscalização do seu microambiente e em contante comunicação com as células que os rodeiam, os astrócitos são considerados células altamente sensitivas, capazes de avaliar o meio e atuar rapidamente de forma a garantir a homeostase e plasticidade do SNC. Por outro lado, a microglia é a população fagocítica e imunocompetente no SNC, responsável pela resposta inflamatória. Apesar da eficaz resposta inflamatória, após infeção ou dano, ser decisiva para preservar o funcionamento do SNC, uma resposta inflamatória prolongada ou exacerbada é uma característica de várias doenças do SNC, nomeadamente isquemia cerebral. Assim, esta tese pretende contribuir para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas (i) que melhorem a sensitividade dos astrócitos em relação ao seu microambiente e (ii) que limitem a resposta inflamatória da microglia, promovendo a homeostase do SNC no contexto desta doença. O monóxido de carbono (CO) é um gás endógeno que resulta da degradação de grupos heme pela enzima heme oxigenase. O CO é descrito na literatura como anti-inflamatório, anti apoptótico e capaz de modular o metabolismo celular. Tratamento com doses baixas de CO ou promoção de produção de CO endógeno limita a morte celular e neuro-inflamação in culturas de neurónios, astrócitos e microglia, assim como em modelos in vivo de AVC e isquemia cerebral neonatal. Ainda assim, os parceiros moleculares do CO ainda não estão completamente descritos. O estudo destes parceiros nos mecanismos protetores do CO irá permitir um estudo mais aprofundado no papel biológico deste gás, podendo levar ao desenvolvimento de melhoradas terapias baseadas no CO, em particular para a isquemia cerebral. Assim, esta tese tem como objetivo entender com maior profundidade os mecanismos moleculares de proteção promovida pelo CO, em células da glia. O capítulo I introduz informação publicada relacionada com as células da glia e CO, assim como os seus parceiros Neuroglobina (Ngb) e cílios primários. O capítulo II tem como objetivo perceber o papel da Neuroglobina (Ngb) no efeito anti-inflamatório do CO, na microglia, avaliando a relevância da Ngb da modulação do metabolismo, promovida pelo CO. O capítulo III pretende avaliar a capacidade do CO de modular os cílios primários de astrócitos, organelos estes que permitem a fiscalização do microambiente pelas células. Estes dados são posteriormente discutidos no capítulo IV, sendo também discutidas questões não respondidas por estes resultados e experiências futuras. Por fim, como anexo, o capítulo V apresenta dados que dizem respeito a um manuscrito técnico, em preparação, relacionado com de Novo lipogénese. Este manuscrito foi desenvolvido em colaboração, no âmbito da avaliação da modulação pelo CO do metabolismo microglial.

ABSTRACT: Stroke is a major cause of mortality in Portugal and morbidity related to brain lesion in the world. Ischemic stroke occurs when blood flow is interrupted, depleting oxygen and nutrients supply in the tissue. After, blood flow is re-established, the tissue suffers a second damage due to increased oxidative stress. This disease is characterized by excessive oxidative stress, inflammation, excitotoxicity, and, ultimately, cell death. Although therapies are available, they do not target directly brain tissue and present some limitations in efficacy and a short time window of application. Therefore, novel therapeutic approaches against cerebral ischemia are urgently needed. The rational of this thesis is to target glial cells for promoting cerebral protection by limiting neuroinflammation and glial cell death. Central nervous system (CNS) associated disorders are usually considered as a neuronal issue. However, glia are key cells implicated in stress response and involved in neuroprotection; prevention of glial dysfunction strongly protects brain tissue and, ultimately, the patient outcome. Glial cells, such as astrocytes and microglia, are the major cellular group of the brain. These cells are vital players in the brain homeostasis, having roles in development and synaptic plasticity, inflammatory response, metabolic support, and neuronal survival. Astrocytes have important functions in modulation and maturation of synapsis, metabolic support and redox and excitotoxicity protection of neurons. Being in constant microenvironment sensing and in communication with their neighbours, astrocytes are highly sensitive cells able to perform a quicky evaluation of the CNS and quicky intervene to ensure homeostasis and plasticity. On the other hand, microglia are also phagocytic and immunocompetent cell population responsible for the inflammatory response. Although an efficient inflammatory response against infection or injury is crucial to preserve the CNS function; prolonged or exacerbated inflammation is a hallmark of several CNS diseases, namely cerebral ischemia. Therefore, this thesis intends to contribute to the development of approaches (i) that improve astrocyte responsiveness to their microenvironment, and (ii) that limit microglial neuroinflammatory response, which may promote CNS homeostasis, namely against cerebral ischemia. Carbon monoxide (CO) is an endogenous gas that results from haem degradation by the enzyme haem oxygenase. CO is widely described in the literature as an anti neuroinflammatory, an anti-apoptotic and a modulator of cell metabolism molecule. Exposure to low doses of CO or to endogenous CO limits cell death and neuroinflammation in cultures of neurons, astrocytes and microglia, as well as in in vivo models of stroke and neonatal hypoxia ischemia. Nevertheless, CO’s downstream players are not fully described. Disclosing CO’s partners in its protective molecular mechanism will allow a deeper understanding of CO’s biological role, potentially leading to the development of better CO-based therapies, particularly against cerebral ischemia. Therefore, this thesis aims to deeper understand the underlying molecular mechanisms of in CO’s cytoprotection in glia cells. Chapter I introduces main information present in the literature regarding glial cells and CO, as well as the downstream player candidates, Neuroglobin (Ngb) and primary cilia. Chapter II targets the role of Ngb on CO’s anti inflammatory role in microglia, in particular by assessing Ngb relevance in CO’s modulation of cellular metabolism. Chapter III focuses on the ability of CO to modulate the astrocytic primary cilia, which are organelles related to the surveillance of the microenvironment of the cell. These data are then discussed in Chapter IV, where unanswered question and important future work is proposed. Finally, as an annex, Chapter V presents data regarding a technical manuscript in preparation, focused on de novo lipogenesis. This manuscript was developed in collaboration, within the scope of the assessment of CO’s modulation of microglial metabolism.