RESUMO: O cancro da tiroide (CT) associa-se geralmente a um excelente prognóstico, apresentando a maioria dos casos um curso indolente de doença. Contudo, torna-se verdadeiramente desafiante quando metastiza à distância ou se desdiferencia. O CT mais agressivo, e uma das neoplasias mais letais, é o carcinoma anaplásico da tiroide (CAT). Apesar de raro, o CAT é responsável por um número importante de mortes atribuíveis ao CT. A terapêutica com iodo radioativo (TIRA) continua a ser a primeira linha na abordagem dos carcinomas bem diferenciados da tiroide (CBDT) com metastização à distância. A sobrevida aos 10 anos nos doentes cujas metástases captam iodo radioativo é de aproximadamente 60%, sendo apenas de 10% nos doentes refractários à TIRA. Para melhor se caracterizar a evolução clínica destes doentes, é de extrema importância investigar os marcadores clínicos e moleculares que possam predizer a resposta à TIRA. Para além disso, existem ainda alguns conceitos associados a este tratamento, no que respeita às suas indicações e métodos de preparação, no contexto metastático, que continuam por esclarecer. A activação da via das MAPK, através das mutações do RAS e BRAF, ou de fusões de genes, pode promover a iniciação do CT; subsequentemente, alterações adquiridas na via do PIK/AKT e no TP53 podem ser responsáveis pelo processo de desdiferenciação do CBDT para o pouco diferenciado (CPDT) e CAT. Nos últimos anos, o espectro molecular do CT tem vindo a ser alargado, sobretudo às custas da introdução de tecnologias mais modernas, como a sequenciação de nova geração (SNG), o que nos tem permitido compreender melhor o comportamento destes tumores. O gene EIF1AX foi recentemente descrito como associado ao desenvolvimento de CT num estudo com uma grande coorte de carcinoma papilar da tiroide (CPT). Posteriormente, foram descritas mutações neste gene em tumores agressivos, como os CPDT e CAT, nos quais coexistem frequentemente com mutações no genes RAS, tendo sido ainda descritas mutações no EIF1AX em lesões benignas. Portanto, interrogou-se se este gene estaria envolvido em todos os passos de tumorigénese do CT ou se se associaria apenas a progressão e agressividade. A optimização da abordagem terapêutica dos CT agressivos passa por aprofundar o nosso conhecimento acerca do seu comportamento clínico e genético. Portanto, o objectivo global deste trabalho consistiu em realizar uma análise extensiva do comportamento clínico destes tumores agressivos da tiroide e expandir o seu espectro molecular, tentando associar os genotipos encontrados aos resultados das terapêuticas utilizadas. Pretendemos também clarificar o processo de desdiferenciação do CT e estabelecer novos modelos in vitro para o estudo destes tumores raros. Para cumprir estes objectivos, começámos por caracterizar o comportamento clínico de uma coorte de CT metastático, considerando a sua apresentação clínica e abordagem terapêutica. Realizámos uma análise retrospectiva da evolução clínica de 27 doentes com metástases cerebrais do CT, que constituiu uma das maiores coortes publicadas até à data. As metástases cerebrais são raras no CT, mas podem associar-se a sintomatologia de início súbito e altamente incapacitante, e também a uma marcada redução da sobrevida dos doentes. O CPT foi o histotipo mais frequente na nossa coorte. Ao diagnóstico de metastização cerebral, 77,8% dos doentes apresentavam já doença plurimetastática. A sobrevida mediana após a detecção das metástases cerebrais foi de 5,0 meses e o único factor que melhorou a sobrevivência específica de doença (SED) foi a ressecção da metástase (p=0,012). Também caracterizámos uma coorte de 86 CBDT com metastização óssea, cujo histotipo mais frequente foi o CPT variante folicular (CPTvf). A metastização óssea constituiu a primeira manifestação do CT em 36,0% dos doentes e 59,3% dos casos apresentavam envolvimento ósseo múltiplo. Ocorreram eventos relacionados com a metastização óssea (ERMO) em 76,7% dos doentes. Após analisarmos os factores associados à SED, tais como a idade ao diagnóstico, o tipo histológico, presença de ERMO e a avidez inicial na TIRA, apenas a última apresentou um impacto significativo na SED. A sobrevida aos 5 e 10 anos foi de 76,0 e 67,0% nos doentes com metástases ávidas, e de 44,0 e 31,0% naqueles sem avidez (p=0,002 e p=00,002, respectivamente). Para além da caracterização clínica destas coortes, pretendemos ainda responder a algumas das questões-chave ainda não clarificadas no que respeita à TIRA. A correcta preparação para esta terapêutica requer a elevação dos níveis de TSH (thyroid-stimulating hormone), que pode ser alcançada através da suspensão da levotiroxina (SLT) ou através da administração de TSH recombinante (rhTSH). Contudo, a rhTSH apenas se encontra recomendada no contexto de doença metastática em casos selecionados. Para além disso, a literatura que compara os resultados da SLT vs. rhTSH nos casos de doença à distância é ainda escassa. Nesse sentido, realizámos um dos maiores estudos (n=95) que envolveu apenas CPT com doença metastática e avaliou os resultados da TIRA preparada com SLT vs. administração de rhTSH. Verificámos que não houve diferença estatisticamente significativa entre os dois métodos de preparação para TIRA, no que concerne à avidez e resposta clínica. Portanto, este estudo demonstrou que a rhTSH é igualmente eficaz na preparação da TIRA no contexto de doença à distância, uma vez que apresenta resultados clínicos semelhantes à SLT e evita que o doente seja exposto a longos períodos de hipotiroidismo. As recomendações para o uso de TIRA nos CBDT metastáticos são baseadas sobretudo na experiência advinda dos CPT, que são, de longe, o histotipo de CT mais frequente, e não têm em consideração as diferenças entre os tipos de CT no que respeita à fixação e à resposta. Nesse sentido, analisámos uma série de 126 doentes com metastização à distância: 42 (33,3%) apresentavam CPT variante clássica (CPTvc), 45 (35,7%) CPTvf, 17 (13,5%) carcinoma folicular da tiroide (CFT) e 22 (17,5%) carcinoma de células de Hürthle (CCH). Julgamos que este constituiu um dos maiores estudos que avaliou o impacto dos diferentes histotipos de CT nos resultados da TIRA. Os doentes com CCH apresentaram a menor avidez para o iodo (apenas 13,6%) apresentaram fixação; aqueles com CPTvc apresentaram avidez intermédia (21,4%) e a fixação mais intensa foi observada nos doentes com CPTvf (75,6%) e CFT (76,5%). Tendo em conta a resposta clínica à TIRA, não se verificaram diferenças entre os CFT e CCH, sendo que ambos progrediram mais frequentemente que os CPT, mas a taxa de progressão foi semelhante entre CPTvf e CPTvc. No nosso estudo, o tipo histológico influenciou significativamente a sobrevida livre de progressão (SLP) (p=0,014) mas não teve qualquer impacto na SED. De forma a aprofundarmos a nossa percepção acerca da eficácia da TIRA, procedemos à caracterização clínica de 122 CPT metastáticos, tendo em conta os resultados após a TIRA. A maioria dos doentes (59,0%, n=71) progrediu após a TIRA, com uma SLP estimada mediana de 30,0 meses. Verificámos também que a idade, o sexo e o tamanho das metástases constituíram factores de prognóstico comuns à avidez, SLP e SED. Investigámos, ainda, os perfis moleculares de 31 tumores primários de CPT metastático, de acordo com a resposta à TIRA, através de SNG, usando um painel multigene desenhado por nós. Nesta série de tumores primários, verificámos que os genes mais frequentemente alterados foram as isoformas do RAS (54,8%) e o promotor do TERT (pTERT) (51,6%). As alterações do BRAF e RET/PTC associaram-se a menor avidez. As mutações do pTERT não se associaram a menor avidez mas foram preditoras de uma tendência para progressão (p=0,063). Concluímos ainda que a activação da via da MAPK pelo BRAF ou RET/PTC, ou a dupla activação das vias da MAPK pelo RAS e da PI3K/AKT pelo PIK3CA, em conjunto com as mutações do pTERT, podem influenciar negativamente a actividade do simporter de sódio/iodo (NIS). Com o objectivo de elucidarmos o papel do EIF1AX na progressão e desdiferenciação do CT, estudámos a sua presença em 16 casos de PDTC/ATC com áreas benignas e/ou bem diferenciadas, coexistentes ou metácronas, abordagem que não tinha sido investigada até à data. Não detectámos mutações do EIF1AX em áreas benignas mas apenas em tumores malignos. Verificámos que a mutação p.Ala113_splice, característica do CT, foi identificada em 2 CPDT, não estando presente nas áreas correspondentes benignas ou de CPT, e num desses casos ocorreu após mutação no NRAS. Portanto, este estudo demonstrou que a alteração p.Ala113_splice parece ser um marcador de agressividade. Caracterizámos, ainda, a evolução clínica de uma coorte de CAT através da análise retrospectiva de 79 doentes seguidos no nosso centro. Reportámos, assim, a maior experiência com CAT do país e uma das maiores da Europa. Verificámos que a SED mediana após o diagnóstico foi de apenas 2,0 meses. A abordagem terapêutica multidisciplinar, consistindo em cirurgia, radioterapia e quimioterapia, foi a única variável com impacto na melhoria da SED (p<0,001). Por fim, estabelecemos e caracterizámos uma nova linha celular de CAT (3948) derivada de um doente de 66 anos com um tumor irressecável, obtida por citologia aspirativa com agulha fina. Tínhamos como objectivo estabelecer novos modelos in vitro para o estudo de CAT. Esta linha celular manteve o fenótipo representativo das células de CAT originais, apresentando um cariótipo completamente aberrante, com várias perdas e ganhos cromossómicos e, também, mutações nos genes TP53, STK11 e DIS3L2. Portanto, linhas celulares humanas, como a que apresentamos, derivadas de tumores raros, irressecáveis e heterogéneos, representam um modelo in vitro extremamente útil para estudar o comportamento destes tumores e individualizar as abordagens terapêuticas. Em suma, este trabalho permitiu expandir o nosso conhecimento acerca da evolução clínica destas formas agressivas de CT. Para além disso, através da análise molecular de tumores primários verificámos ser possível predizer os resultados à terapêutica. Acreditamos que demos um passo na direcção da implementação de uma medicina verdadeiramente personalizada, uma vez que o comportamento do CT é um continuum, desde as suas alterações somáticas, até ao seu histotipo, sua evolução clínica e resultados terapêuticos.

ABSTRACT: Thyroid cancer (TC) usually portends a very favourable prognosis, with an indolent disease course in the majority of the cases. However, when it spreads for distant organs or dedifferentiates, it becomes a clinical challenge. The most aggressive TC, and one of the most lethal malignancies, is anaplastic thyroid cancer (ATC). Although rare, ATC accounts for an important number of all deaths attributable to thyroid tumours. Radioiodine therapy (RAIT) remains the main choice for metastatic well differentiated thyroid cancer (WDTC). The 10-year survival rate among patients with metastatic thyroid cancer that retain RAI avidity is approximately 60%, whereas it is only 10% in RAI refractory (RAIR) patients. To better characterise the clinical evolution of these patients, it is of utmost importance to investigate the clinical and molecular markers that may predict RAIT outcomes. Furthermore, there are some concepts associated with RAIT indications and methods of preparation, in the metastatic context, that remain to be elucidated. The activation of MAPK pathway, through mutated RAS or BRAF, or gene fusions, may promote TC initiation; later acquired alterations in PIK/AKT pathway and TP53, may be responsible for the process of dedifferentiation from WDTC to poorly-differentiated (PDTC) and ATC. In the last years, the molecular spectrum of TC has been extended and our understanding about the biological behaviour of these tumours has improved, mostly due to the use of novel technologies, such as next-generation sequencing (NGS). Recently, EIF1AX was described as a novel TC driver gene in a large papillary thyroid cancer (PTC) analysis. Mutations in this gene were then reported in highly aggressive tumours, such as PDTC and ATC, frequently co-existing with RAS mutations, and also in benign lesions. Thus, it was not clear whether this gene was present in all stages of tumourigenesis or only represented a step towards TC aggressiveness. The best way to optimise aggressive TC management is to wide our knowledge about their clinical behaviour and genetic background. Thus, the main aims of this work were to perform a comprehensive analysis of the clinical behaviour of these aggressive thyroid cancers, to expand its molecular spectrum and investigate its association with therapy outcomes. We also aimed to clarify the process of dedifferentiation, and to establish new models for in vitro studies of these rare tumours. To accomplish these goals, we firstly characterised the clinical behaviour of a cohort of metastatic TC, regarding clinical presentation and therapeutic approaches. We started by performing a retrospective analysis of the clinical outcomes of 27 patients with brain metastasis from TC, that was one of the largest cohorts published to date. Brain metastasis are rare in TC, but may cause acute disabling symptoms and a marked reduction of patients’ survival. PTC was the commonest histological type in our study. Other distant metastases were already present in 77.8% of the patients at brain metastasis diagnosis. Median survival since brain metastasis detection was 5.0 months, and the only factor associated with longer disease-specific survival (DSS) in our cohort was surgery to brain metastasis (p=0.012). We also characterised a cohort of 86 patients with bone metastasis from WDTC; this derived more frequently from follicular variant PTC (fvPTC). Bone metastasis was the initial presentation of TC in 36.0% of the patients, and 59.3% of the cases showed multiple bone involvement. Skeletal-related events (SRE) occurred in 76.7% of the patients. When analysing the independent factors associated with DSS, such as age at diagnosis, histological type, presence of SRE, and initial metastatic RAI avidity, only the last one had a significant impact on DSS. The five- and 10- year survival was 76.0 and 67.0% if the lesions were RAI avid, and 44.0 and 31.0% if the lesions were non-avid (p=0.002 and p=0.002, respectively). After the clinical characterisation of these cohorts, we intended to address key unanswered questions associated with RAIT. The correct preparation for RAIT requires an adequate rise of TSH (thyroid-stimulating hormone) levels, which may be achieved by levothyroxine withdrawal (LTW) or by the administration of recombinant TSH (rhTSH). Current international guidelines only recommend rhTSH-aided RAIT, in metastatic context, in selected patients. Furthermore, there are only a few studies comparing rhTSH with LTW outcomes in distant metastatic disease. We performed one of the largest studies (n=95) comparing the clinical outcomes of rhTSH vs. LTW-mediated RAIT in metastatic PTC. Our data revealed no statistically significant difference between the two methods of RAIT preparation, regarding RAI avidity and clinical response. Thus, this study evidenced that rhTSH is equally effective in RAIT preparation in the context of distant metastatic disease, as it presents similar clinical outcomes to LTW, and saves the patients from a prolonged hypothyroid state. The recommendations for the use of RAIT in distant metastatic WDTC are mostly based in the experience with PTC, by far the most frequent thyroid tumour, and do not take into account the differences within the different types of DTC in terms of RAIT uptake and response. We analysed a cohort of 126 patients with distant metastatic disease in terms of RAIT outcomes: 42 (33.3%) classical variant PTC (cvPTC), 45 (35.7%) fvPTC, 17 (13.5%) follicular thyroid cancers (FTC), and 22 (17.5%) Hürthle cell carcinomas (HCC). To our knowledge, this was one of the largest studies analysing the impact of the main DTC histotypes in RAIT outcomes. RAI avidity was lowest in HCC (only 13.6% showed uptake), intermediate in cvPTC (21.4%), and highest in fvPTC (75.6%) and FTC (76.5%). Regarding RAIT response, HCC and FTC were not different; both showed significantly more often progression after RAIT than PTC, but the rate of progression was similar between fvPTC and cvPTC. In our study, histology independently influenced estimate progression-free survival (PFS) (p=0.014), but tumour type was not a significant prognostic factor in DSS. In order to extend the present knowledge regarding RAIT effectiveness, we assessed the clinical features of 122 metastatic PTC according to RAIT outcomes. The most frequent outcome in the present series was progression of disease, that occurred in 59.0% of cases (n=71), with median estimate PFS of 30.0 months. Furthermore, we observed that age, gender and metastasis dimension were the common prognostic factor for RAI avidity, PFS and DSS. We further characterised the genetic spectrum of 31 metastatic PTC, and the molecular profiles associated with distinct RAIT outcomes, through NGS, using a custom made multigene panel. In the series of 31 primary PTC specimens, the most frequently mutated genes were RAS isoforms (54.8%) and TERT promoter (TERTp) (51.6%). BRAF and RET/PTC alterations were associated with lower RAI avidity. TERTp mutations were not predictive of lower uptake, but portended a tendency for a higher rate of progression (p=0.063). Our data support the activation of MAPK by BRAF or RET/PTC, or the double activation of MAPK by RAS and PI3K/AKT pathways by PIK3CA, along with TERTp mutations, as important contributors to sodium/iodine symporter (NIS) dysfunction. To accomplish the goal of clarifying EIF1AX role in the progression and dedifferentiation of TC, we studied 16 cases of coexisting, or metachronous, benign, differentiated and poorly differentiated or anaplastic thyroid lesions, which, to the best of our knowledge, had not been addressed simultaneously. EIF1AX mutations were not detected in benign counterparts, and were present only in malignant lesions. The mutation p.Ala113_splice, a unique TC alteration, was identified in two PDTC, but not in coexisting PTC or benign regions, and in one of those patients it occurred only after NRAS mutation. Thus, this study showed that the p.Ala113_splice alteration is likely to be a marker of thyroid cancer aggressiveness. We also characterised the clinical behaviour of a series of ATC patients. We performed a retrospective analysis of 79 ATC patients followed at our referral centre, which reflected the largest experience with ATC in the country and one of the largest reported cohorts from Europe. We observed that median DSS after ATC diagnosis was only 2.0 months. Only the therapeutic approaches had a significant impact in DSS: multimodality therapy with surgery, radiotherapy and chemotherapy had the greatest impact. Finally, in the quest for novel in vitro models to study ATC, we successfully established and characterised a new patient-derived ATC cell line (3948), obtained through fine needle aspiration cytology (FNAC), of a 66-years-old male with an unresectable tumour. This cell line maintained the phenotype representative of original ATC cells, and a completely aberrant karyotype with many chromosomal losses and gains; it also showed mutated TP53, STK11, and DIS3L2 genes. Human cancer cell lines, such as this one, derived from a rare, usually unresectable, and heterogeneous tumour type, generated from FNAC cells, may represent a valuable in vitro model system to study cancer behaviour and to individualise therapeutic approaches. Overall, this work expanded our understanding about the clinical evolution of these aggressive forms of TC, and it also contributed to improve the knowledge on the prediction of therapy outcomes based on the molecular study of primary tumours. We believe that we took a step further in the attempt to implement a truly personalised medicine, as TC behaviour is a continuum, from somatic molecular alterations, to its histotype, its clinical behaviour, and therapeutic outcomes.