RESUMO: Apesar dos avanços no conhecimento dos mecanismos neurotóxicos e dos aspetos clínicos da doença de Alzheimer (AD), a sua etiologia permanece pouco clara. As espécies tóxicas do péptido β-amiloide (Aβ) desregulam a sinalização de Ca2+ nos astrócitos, levando a gliotransmissão anómala. Sabe-se que os gliotransmissores glutamato e D-serina ativam recetores NMDA (NMDARs), que são fundamentais na plasticidade sináptica (ex.: potenciação de longo prazo (LTP)) e na memória, podendo ser neuroprotetores (sinápticos, sNMDAR) ou iniciar vias de morte celular (extra sinápticos, eNMDAR). Assim, levantámos a hipótese de que o Aβ: (1) exacerba a liberação de glutamato dos astrócitos, ativando excessivamente os eNMDAR e aumentando a excitabilidade neuronal e, concomitantemente, (2) diminui a liberação de D-serina, reduzindo a ativação dos sNMDAR, comprometendo a plasticidade sináptica com subsequente disfunção da memória. Assim, o nosso objetivo foi investigar como é que alterações na sinalização astrócitos-neurónios suprimem os mecanismos de plasticidade sináptica e contribuem para os déficits de memória observados na AD. Utilizamos murganhos transgénicos dn-SNARE, onde a gliotransmissão dependente de SNARE é seletivamente comprometida nos astrócitos. Para estudar a plasticidade sináptica, induzimos um protocolo de LTP nas fatias de hipocampo dos animais dn-SNARE e Wt incubadas com oligomeros Aβ1-42 (200 nM) e/ou D-serina (10 μM). Em paralelo, injetamos no hipocampo de animais dn-SNARE e Wt vetores AAV que transportam a forma mutada da proteína precursora de amiloide humana (APP) e presenilina 1 (PS1), de modo a mimetizar o padrão de expressão da APP observado no hipocampo de pacientes com AD. Os animais foram submetidos a três testes de comportamento: open field (OFT) (locomoção, ansiedade e exploração), Y-maze de alternância espontânea (memória de trabalho espacial) e Morris water maze (MWM) (memória espacial e de longa duração). Adicionalmente, culturas primárias de astrócitos foram transfetadas com um biossensor de FRET para avaliar o impacto da presença de oligomeros de Aβ1-42 (200 nM) na liberação de glutamato pelos astrócitos. O nosso trabalho mostra que: (1) o comprometimento da gliotransmissão recupera a inibição da LTP mediada pelos oligomeros de Aβ1-42; (2) os astrócitos libertam mais glutamato na presença de oligomeros de Aβ1-42; e (3) a D-serina promove a ativação dos sNMDAR e potencializa a indução de LTP, mesmo na presença de oligomeros de Aβ1-42. Os resultados preliminares dos testes de comportamento sugerem que apenas no MWM o comprometimento da gliotransmissão parece melhorar os déficits de memória causados pelo processamento de APP. Os nossos resultados atribuem um papel central aos astrócitos na plasticidade sináptica e à disfunção de memória na AD, abrindo portas para abordagens e novos alvos terapêuticos para o tratamento da AD.

BSTRACT: Although new insight has been gained about the neurotoxic mechanisms and the clinical aspects of Alzheimer’s disease (AD), the actual neuropathogenic processes remain unclear. Amyloid-β (Aβ) toxic species, an AD hallmark, induce an astrocytic Ca2+-signaling dysregulation with consequent abnormal gliotransmission. Glutamate and D-serine gliotransmitters activate NMDA receptors (NMDARs), which play an important role in synaptic plasticity (eg: long-term potentiation (LTP)) and memory function, and can be neuroprotective (synaptic, sNMDAR) or initiate cell death pathways (extrasynaptic, eNMDAR). Thus, we hypothesize that Aβ: (1) exacerbates astrocytic glutamate release, excessively activating eNMDARs and increasing neuronal excitability; (2) and reduces D serine release, poorly activating sNMDAR, which overall leads to the disruption of synaptic plasticity with subsequent memory impairment. Therefore, we aim to investigate how, in AD, changes in astrocyte-neuron signaling suppress synaptic plasticity mechanisms and contribute to memory deficits. To clarify this, we used dn-SNARE transgenic mice, where SNARE-dependent gliotransmission is selectively disrupted in astrocytes. To study synaptic plasticity, we induced an LTP protocol in hippocampal slices, from dn-SNARE and Wt animals, incubated with Aβ1-42 oligomers (200 nM) and/or D-serine (10 μM). In parallel, we injected in the hippocampus of dn-SNARE and Wt mice AAV vectors carrying the mutated form of human amyloid precursor protein (APP) and presenilin 1 (PS1), to mimic the pattern of APP expression observed in the hippocampus of human AD patients. Then, the animals were submitted to the open field test (OFT) (locomotion, anxiety, and exploration), Y-maze spontaneous alternation (spatial working memory), and Morris water maze (MWM) (spatial and long-term memory). Additionally, primary astrocyte cultures were transfected with a FRET-glutamate biosensor, to evaluate the impact of Aβ1-42 oligomers (200 nM) on glutamate release by astrocytes. Our work shows that the etiology and treatment of AD can be mechanistically linked via astrocytes since: (1) impairing gliotransmission restores LTP inhibition mediated by Aβ1-42 oligomers; (2) astrocytes release more glutamate in the presence of Aβ1-42 oligomers; (3) D-serine enhances sNMDAR activation and potentiates LTP induction, even in the presence of Aβ1-42 oligomers. Besides, behavioral preliminary results suggest that AAV-APP/PS1 injection does not induce an alteration in OFT nor Y-maze test. However, in MWM, gliotransmission impairment seems to ameliorate memory deficits caused by AD-like APP processing, suggesting a role of astrocytes in memory decline in the early stage of AD. Together, our results place astrocyte at the central hub for synaptic plasticity and memory dysfunction in AD, opening the search for innovative approaches and targets for AD treatment.