RESUMO:Os exossomas são vesículas extracelulares libertadas pela maioria das células e que possuem a capacidade de transmitir informação a grandes distâncias através do transporte de lípidos, ácidos nucleicos e proteínas a células, tecidos ou órgãos. Uma vez dentro da célula, os exossomas conseguem modular as mais diversas funções biológicas. Pese embora os mecanismos que regulam a composição destas vesículas continuem por esclarecer, diversos autores já reportaram que o conteúdo dos exossomas é diferente do conteúdo citosólico da célula de origem, deixando implícito a existência de um mecanismo de triagem para o controlo do conteúdo destas vesículas. Neste trabalho de investigação propomos um novo modelo onde o direcionamento de proteínas para os exossomas depende de um conjunto de moléculas de onde se destacam a proteína membranar LAMP2A (Lysosomal Associated Membrane Protein 2A) e o chaperone molecular HSC70 (Heat Shock Cognate Protein 70). Propomos ainda que as proteínas que possuam sequências peptídicas específicas, com afinidade acrescida para a HSC70, tenham maior probabilidade de serem selecionadas e transportadas para os exossomas. Está demonstrado que o complexo proteico constituído pela LAMP2A e pela HSC70 participa na translocação de proteínas através de membranas lipídicas (8), num processo designado por Autofagia Mediada por Chaperones. Neste mecanismo a HSC70 reconhece um pentapeptídeo específico que está imbuído na sequência das proteínas e que é bioquimicamente semelhante ao motivo KFERQ. Depois de serem reconhecidos pela HSC70, os substratos são dirigidos para o lisossoma, onde a LAMP2A se encarrega de os transportar para o seu lúmen. Neste estudo sugerimos que o complexo LAMP2A-HSC70 pode também participar na triagem dos conteúdos proteicos noutras vesiculas lipídicas, nomeadamente nos exossomas. Os resultados obtidos neste estudo corroboram a nossa hipótese já que demonstramos que a LAMP2A é necessária para o carregamento de proteínas que contêm motivos KFERQ em exossomas. Os resultados mostram que quando eliminamos LAMP2A das células, há uma diminuição na quantidade de proteínas com o motivo-KFERQ nos exossomas. O mecanismo de carregamento de proteínas acontece na membrana dos endossomas primários e tardios, aquando da formação das vesículas intraluminais e é dependente da LAMP2A. De forma a estudar em maior detalhe os mecanismos moleculares envolvidos na seleção de proteínas para os exossomas, criámos uma proteína quimérica, à qual fundimos o motivo de reconhecimento ExoSinal, semelhante ao motivo KFERQ. Os resultados obtidos demonstram que o ExoSinal é determinante para a presença da proteína quimérica nos exossomas. Acresce que, através de uma análise detalhada dos intervenientes moleculares envolvidos da seleção de proteínas para os exossomas, o chaperone molecular HSC70 é fundamental para este processo. Por outro lado, o componente do complexo de transporte de endossomas, TSG101, não está envolvido neste processo. Já a proteína Rab27 mostrou ser importante para a libertação de exossomas enriquecidos na proteína quimérica. Adicionalmente, neste trabalho, focámo-nos no fator de transcrição associado à hipoxia HIF1A (Hypoxia Inducible Factor 1alpha). Este fator de transcrição tem na sua sequência de aminácidos um motivo semelhante ao motivo KFERQ, por essa razão utilizámo-lo como modelo para o estudo de carregamento seletivo de proteínas em exossomas. Em hipoxia, as células libertam exossomas enriquecidos e HIF1A. No entanto, quando eliminamos a LAMP2A das células, o HIF1A já não consegue ser libertado em exossomas. Para melhor entender a relevância biológica da presença de HIF1A em exossomas, realizámos estudos in vitro e in vivo, que sugerem que o HIF1A exossomal é biologicamente ativo e é capaz de iniciar respostas celulares. Como a sinalização através de exossomas está envolvida em processos biológicos tão diversos como a resposta imunitária, a apresentação de antigénios, a angiogénese, a inflamação e proteostase, é provável que o nosso mecanismo possa ser importante em processos como o cancro, a inflamação e uma longa lista de doenças crónicas e degenerativas relacionadas com o envelhecimento (2). Na segunda parte deste trabalho propusemo-nos a explorar o papel dos exossomas na secreção de material proteotóxico para o espaço extracelular. A desregulação da proteostase é uma das principais características de doenças relacionadas com o envelhecimento, onde existe uma acumulação de material toxico, quer sejam oligómeros de proteínas ou agregados de proteínas insolúveis, dentro e fora da célula. Neste contexto, inativámos uma proteína essencial no controlo de qualidade e na regulação da proteostase, a ligase de ubiquitina STUB1. Os nossos resultados indicam que a deficiência em STUB1 leva a uma acumulação intracelular de material proteotóxico e um aumento de libertação de exossomas. Estes exossomas são enriquecidos em material ubiquitinado, proteínas não degradadas e oligómeros de proteínas. Os nossos resultados demonstram que o stress oxidativo leva a uma maior libertação de exossomas quando a STUB1 não está ativa. No geral, os nossos resultados demonstram que as células utilizam os exossomas como forma de se libertar de material proteotóxico.

ABSTRACT: Exosomes are extracellular vesicles secreted by most cell types that can signal to distant cells, tissues or organs, by carrying and delivering lipids, nucleic acids and proteins. Once inside the target cells, the contents of exosomes are capable of modulating many biological functions. The mechanisms whereby cells regulate exosomal composition remain largely unknown. Nevertheless, several reports show that the cargo repertoire of exosomes does not necessarily reflect the cytosolic contents of the originating cell, suggesting that a mechanism of cargo triage is likely to determine the contents of these vesicles. In this work we propose that the sorting of proteins into exosomes relies on a rather complex molecular machinery, involving the membrane receptor-like protein LAMP2A (Lysosomal Associated Membrane Protein 2A) and the molecular chaperone HSC70 (Heat Shock Cognate Protein 70). Furthermore, we suggest that proteins containing specific peptide sequences, that have increased affinity to HSC70, are more likely to be translocated into exosomes. The LAMP2A-HSC70 complex was shown to participate in protein translocation across lipid membranes in a process known as Chaperone-Mediated Autophagy. In this mechanism, HSC70 recognizes a specific pentapeptide sequence, biochemically related to the KFERQ-motif, and the substrate proteins are subsequently targeted to the lysosome, where LAMP2A mediates the translocation of substrate proteins into the lysosomal lumen. In this work we suggest that the LAMP2A-HSC70 complex is likely to participate in the selection of cargo to other lipid vesicles such as exosomes. Our results support this hypothesis, since we show that LAMP2A is required for the sorting of proteins containing KFERQ-like signals into exosomes, as the Knock-Out of LAMP2A decreases the levels of some KFERQ-motif containing proteins in exosomes. Moreover, we show that the triage mechanism happens in the nascent Intraluminal Vesicles (ILVs) at the Early and Late Endosomal membranes (EE/LE), in a LAMP2A dependent manner. In order to better assess the details of the proposed molecular mechanism, we created a chimeric protein fused to ExoSignal (PAmCherry + KFERQ-like motif). Results obtained show that the ExoSignal is a strong signal for the presence of the chimeric protein in exosomes. Moreover, through a thorough evaluation on the molecular players involved in the loading of ExoSignal proteins in exosomes we show that is dependent on the recognition by the molecular chaperone HSC70, is independent of the ESCRT-I component TSG101 and is dependent of the Rab27 GTPase. Moreover, we have also focused our studies on the KFERQ-motif carrying HIF1A transcription factor (Hypoxia Inducible Factor 1alpha) as a model substrate for selective exosomal loading. Exosomes released by cells under hypoxia are enriched in HIF1A, whereas LAMP2A KO cells show undetectable levels of HIF1A. Additionally we assessed the biological impact of exosomal HIF1A. Studies performed in vitro and in vivo show that HIF1A in exosomes biologically active and it is sufficient to initiate a hypoxic response in receiving cells. Since signaling through exosomes is important in processes such as immune response, antigen presentation, angiogenesis, inflammation and proteostasis, the proposed molecular mechanism is likely to be of relevance in conditions such as cancer, inflammation, and a wide array of degenerative, age-related diseases. In the second part of this work focused in the study of the role of exosomes in the secretion of toxic or otherwise unwanted proteins into the extracellular space. Deregulation of proteostasis is a main feature of many age-related diseases, often leading to the accumulation of toxic oligomers and insoluble protein aggregates that accumulate intracellularly or in the extracellular space. Therefore, we inactivated the quality-control and proteostasis regulator ubiquitin ligase STUB1/CHIP. Data indicated that STUB1 deficiency leads both to the intracellular accumulation of protein aggregates and to an increase in the secretion of exosomes. Secreted exosomes are enriched in ubiquitinated and/or undegraded proteins and protein oligomers. Data also indicates that oxidative stress induces an increase in the release of exosomes in cells depleted from STUB1. Overall, the results presented here suggest that cells use exosomes to dispose of damaged and/or undegraded proteins as a means to reduce intracellular accumulation of proteotoxic material.