Tese de Doutoramento Biomedicina, Neurologia 2022 Faculdade de Ciências Médicas, Universdade NOVA de Lisboa

RESUMO: Para sobreviver, os animais têm de envigorar adequadamente as suas acções. Apesar da dopamina (DA) ter sido implicada na recompensa e aprendizagem por reforço, a perda de neurónios dopaminérgicos (DANs) da substantia Nigra pars compacta (SNc) leva invariavelmente a défices do movimento e do vigor do movimento. A doença de Parkinson (DP) é uma doença caracterizada por uma perda progressiva, assimétrica dos DANs da SNc. Os sintomas da doença incluem lentidão do movimento, tremor e rigidez – e no início da doença afectam um lado do corpo na ausência de sintomas contralaterais. Face às múltiplas funções descritas para os DANs, permanece pouco claro se os sintomas motores dos doentes com DP se devem a uma "falta de vontade" geral de agir, ou se dimensões específicas do movimento são perturbadas pela perda dos DANs. Reconhecendo a simetria do cérebro e do corpo dos mamíferos, e considerando a assimetria dos sintomas da DP, treinámos ratinhos numa nova tarefa operante self paced que permite a execução de sequências de movimentos utilizando apenas uma das patas. Os ratinhos foram treinados para executar sequências em que carregavam pelo menos 4 vezes na alavanca em menos de um segundo para receberem uma recompensa de sacarose. Graças à organização espacial da caixa, os ratinhos estão limitados a executar esta tarefa utilizando apenas uma das patas dianteiras (a direita ou esquerda). Os animais foram capazes de aprender e executar a tarefa, reduzindo a variabilidade de desempenho com o treino e atingindo uma fase assimptótica de desempenho em que não são encontradas diferenças de performance entre a pata esquerda ou direita. Após injecção unilateral de GCaMP6f floxed na SNc de ratinhos DAT-cre, avaliamos a função in vivo destes DANs geneticamente identificados. Verificámos que diferentes SNc DANs são modulados por diferentes eventos comportamentais: Movimento ou recompensa, independentemente do lado em que a acção foi executada. A identidade dos DANs era estável ao longo dos dias, com actividade semelhante em diferentes sessões após aprendizagem. Os DANs da SNc aumentam transitoriamente a sua actividade antes dos movimentos das patas ipsi e contralateral. No entanto, esta actividade é mais elevada antes das sequências realizadas com a pata contralateral. Depois de executar uma sequência, os ratinhos recolhem a recompensa. Descobrimos que a actividade DA era mais elevada durante as aproximações à recompensa com movimentos contraversivos em comparação com ipsiversivos, mas não foi encontrada evidência de lateralização de resposta nos DANs modulados após a recompensa. Também encontramos evidência de lateralização do vigor do movimento. A actividade dos SNc DANs era mais elevada antes de sequências contralaterais mais longas (em comparação com curtas). Isto não foi encontrado ipsilateralmente. Quando se lesionou os terminais dopaminérgicos da SNc no estriado com uma injecção unilateral de 6-Hidroxidopamina (6-OHDA), descobrimos que esta reduzia o vigor das sequências de movimento contralaterais – mas não ipsilaterais. Em humanos, utilizamos análise cinemática 3D baseada em sensores inerciais, para avaliar a marcha de doentes com DP. Demonstramos que esta marcha é caracterizada por um défice de vigor e alguma assimetria. Conseguimos construir uma nova variável a partir de uma combinação linear de múltiplas dimensões cinemáticas e demonstramos a existência de convergência de validade entre a cinemática e avaliação clínica dos doentes. Mostramos a robustez desta medida numa segunda coorte. A lateralização da actividade dos DANs relacionados com o movimento é consistente com um papel destes neurónios em aspectos cinemáticos do movimento. Este resultado é suportado pelos achados em lesões unilaterais da SNc em ratinhos, assim como pela assimetria observada nos doentes com DP. Não foi encontrada evidência de lateralização nas respostas relacionadas com a recompensa. Isto sugere que diferentes subpopulações funcionais da SNc podem influenciar a aprendizagem e o desempenho de acções por diferentes mecanismos. Na DP, a degeneração dos DANs da SNc segue uma organização espacial. Há uma perda preferencial de DANs na SNc ventro-lateral que progride medial e dorsalmente. Tendo identificado uma heterogeneidade funcional e temporalmente estável dos DANs da SNc, é possível que a degeneração de diferentes partes deste sistema contribua para diferentes sintomas motores e não motores na DP. Clarificar se existe uma ligação entre a heterogeneidade genética e o fenótipo funcional destes neurónios poderá informar futuros estudos sobre a vulnerabilidade selectiva dos neurónios da SNc e guiar estratégias neuroprotectoras. A avaliação de alta resolução dos sintomas motores na DP será fundamental para a descoberta de fármacos neuroprotectores em ensaios de modificação da doença e democratizaria a avaliação clínica dos pacientes

ABSTRACT: To survive, animals must invigorate actions properly. While dopamine (DA) has been implicated in reward and reinforcement learning, experimental loss of dopaminergic neurons (DANs) from substantia Nigra pars compacta (SNc) leads invariably to movement and movement vigor deficits. PD is a condition characterized by a progressive loss of SNc DANs that has been pointed as the cause for asymmetric motor symptoms. Symptoms include movement slowness, tremor and rigidity – and at disease onset they affect one body side without contralateral symptoms. Facing the multiple putative functions of DANs it remains unclear if patients’ movement slowness is due to a general “lack of will” to act, or if movement-specific dimensions are disrupted by DANs loss. Acknowledging mammalian brain and body symmetry, and considering asymmetry in PD symptoms, we trained mice in a novel self-paced operant task that allows the performance of independent single forepaw movement sequences. Mice were trained to perform movement sequences and were rewarded with sucrose if they performed at least 4 lever presses in less than one second. Due to the box spatial constraints, mice would only be able to perform the movement sequences with the left forepaw or with the right forepaw. We found that mice were able to perform the task, reducing performance variability with training and reaching a performance stage with similar performance between left or right forepaw. We assessed the function of genetically identified SNc DANs with in vivo calcium imaging (injecting floxed GCaMP6f unilaterally in the SNc of DAT-cre mice). We found that different SNc DANs were modulated by different behavioural events: Movement or reward, independently of the side the action was performed. SNc DANs identity was stable across days, with similar activity being present across different sessions of performance. SNc DANs transiently increased their activity before either ipsi and contralateral paw movements, in a similar percentage, but this activity was higher preceding contralateral lever press sequences. After performing a sequence, mice ran to the magazine to collect a reward. We found that DA activity was higher during contraversive vs. ipsiversive approaches to the magazine, but no evidence of response lateralization was found in SNc neurons modulated after reward. Evidence of lateralization was also found regarding movement vigor. While SNc DANs activity was higher preceding contralateral longer movement sequences, this was not found ipsilaterally. In fact, when depleted SNc DA with a unilateral striatal injection of 6- Hidroxydopamine (6-OHDA) we found that it disrupted contralateral – but not ipsilateral – movement sequences vigor. Facing the current limitations of clinical assessment of PD patients, we studied self paced gait in PD. Using state-of-art inertial-based 3D kinematic analysis we’ve documented asymmetry and vigor impairment of self-paced gait of PD patients. We were able to construct a new variable from a liner combination of multiple kinematic dimensions demonstrating evidence of convergent validity between kinematics and clinical evaluation of patients. We also demonstrated its’ validity on a second cohort. Evidence of lateralization of movement-related DAN activity is consistent with a role of DANs in aspects of movement more than a general movement invigoration signal. This is supported by unilateral SNc lesions in mice, and in line with the asymmetry observed in patients with PD. No evidence of lateralization was found in reward responses. This suggest that distinct SNc functional subpopulations may influence action learning and performance through different mechanisms. In PD, degeneration of SNc DANs is spatially organized. There is a preferential loss of DANs in the ventro-lateral SNc that progresses medial and dorsally. Having identified a functional and temporally stable heterogeneity of SNc DANs it is possible that degeneration of different parts of this system contributes to different motor and non motor symptoms in PD. Clarifying if there is a link between genetic heterogeneity and functional phenotype of these neurons could inform the studies on selective neuronal vulnerability of SNc neurons and inform neuroprotective strategies. High-resolution assessment of disease state and motor symptoms in PD would facilitate drug discovery in upcoming disease-modifying trials and democratize patients’ clinical assessment