RESUMO: O cancro da mama hereditário é frequentemente associado a genes relacionados com as vias de reparação do DNA, em particular com a reparação dirigida por homologia (HR), a principal via de reparação de quebras duplas de DNA (DSB). Um dos iniciadores precoces desta via é o ATM, uma cinase que sinaliza as DSB e ativa uma cascata de sinalização que leva a duas respostas: paragem do ciclo celular e iniciação da reparação do DNA. Mutações no gene ATM têm sido associadas ao aparecimento de cancro da mama. Portanto, este gene faz parte dos painéis de genes utilizados nos testes genéticos para avaliar o risco de cancro da mama. Uma correta avaliação de risco é crucial para a prevenção do cancro e cuidados médicos adequados. Porém, com o aumento do uso de testes genéticos veio o aumento na deteção de Variantes de Significado Desconhecido (VUS). Perceber o impacto destas variantes é necessário para o paciente compreender o risco e fazer escolhas de prevenção. O nosso objetivo passava por introduzir duas variantes do ATM: uma variante provavelmente patogénica (ATM PAT), descoberta em duas irmãs gémeas com cancro de mama, e uma VUS (ATM VUS) escolhida a partir da base de dados ClinVar. Para atingir este objetivo, pretendíamos estabelecer modelos in vitro destas variantes, utilizando linhas tumorais e não tumorais de mama (MCF-7 e MCF10-A, respetivamente) utilizando o sistema CRISPR-Cas9. Apenas conseguimos estabelecer com sucesso um modelo heterozigota da variante provavelmente patogénica (MCF 7 PAT). Este clone demonstrou uma diminuição de 94% na expressão do ATM comparada com a linha MCF-7 normal. Na análise do ciclo celular, observámos uma disrupção na paragem da fase S. No entanto, os níveis de danos ao DNA medidos através do ɣ-H2AX eram semelhantes nas células com e sem a variante. No ensaio da Anexina V, os resultados não são claros, não sendo possível estabelecer uma relação entre a variante e a morte células. Mais ensaios funcionais deverão ser feitos para perceber melhor o impacto desta variante na resposta aos danos ao DNA.

ABSTRACT: Hereditary breast cancer (BC) is frequently associated with genes involved in the DNA damage response (DDR), particularly the homology recombination (HR), the main pathway for double-strand breaks (DSB) repair. One of its early initiators is ATM, a kinase that senses DSB and activates a signaling cascade that leads to two responses: cell cycle arrest and initiation of DNA repair. Mutations in the ATM gene have been linked to breast cancer, and this gene is part of the gene panel assays for assessing breast cancer risk. An accurate risk assessment is crucial for cancer prevention and proper medical care. However, with the increased use of NGS for genetic testing came the increase in detection of Variants of Unknown Significance (VUS). Understanding the impact of these variants is urgent for patient risk comprehension and prevention choices. We aimed to introduce two ATM variants: a likely pathogenic variant (ATM PAT) discovered in two twin sisters with breast cancer and one VUS (ATM VUS) chosen using the ClinVar database. For achieving this objective, we intended to establish in vitro models of these variants using a human non-tumorigenic breast cells line (MCF10-A) and a human breast tumorigenic cell line (MCF-7) using the CRISPR-Cas9 system. We were only successful in establishing an MCF-7 heterozygote clone (MCF-7 PAT). This clone showed a decrease of 94% in ATM expression compared to MCF-7 cells. In the cell cycle analysis, we observed a disruption in the S-phase checkpoint. However, DNA damage levels measured by ɣ H2AX were similar in cells with and without the pathogenic variant. In the Annexin V assay the results were not clear, and it was not possible to establish a relation between the variant and cell death. More functional assays should be performed for a better understanding of the impact of this variant on DNA damage response.