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Characterization of novel factors regulating neural stem cell proliferation, temporal fate and neuronal diversity / Graça Susete Costa de Carvalho Marques ; orient. Catarina de Cértima Fernandes Homem

Main Author Marques, Graça Susete Costa de Carvalho Secondary Author Homem, Catarina Publication Lisboa : NOVA Medical School , 2022 Description 158 p. : il. Abstract RESUMO: O cérebro é formado por um pequeno número de células estaminais neuronais que dão origem à grande diversidade neuronal no adulto. Para que o cérebro funcione adequadamente, é importante que os neurónios certos sejam formados no momento certo. O cérebro de Drosophila provou ser um ótimo modelo para estudar o desenvolvimento cerebral pois contém um pequeno conjunto de células estaminais neuronais, os neuroblastos (NBs), que geram linhagens neuronais invariáveis ao longo de janelas de desenvolvimento precisas, tornando-se um sistema perfeito para estudar os mecanismos de diferenciação neuronal e diversidade celular. Os perfis transcricionais dos NBs e das suas linhagens são essenciais para especificar o tipo de neurónios formados. Depois dos neurónios serem formados, as suas características terminais neuronais, as quais são essenciais para o funcionamento do neurónio, começam a ser expressas e são mantidas ao longo da vida do neurónio. Assim, para que desenvolvimento cerebral ocorra corretamente, os NBs devem expressar a sequência e combinação corretas de fatores de transcrição ao longo do desenvolvimento do cérebro. Além disso, o processo de diferenciação desde os NBs até aos neurónios também precisa de ser regulado de forma precisa para que os neurónios certos possam ser formados. Embora muitos avanços tenham sido feitos nesta área, o conjunto completo de genes que regula a progressão da linhagem ainda não é conhecido, o mesmo acontece com o conjunto completo de mecanismos que levam a uma maturação e função neuronal adequadas. Os NBs dividem-se para gerar células neurais em janelas temporais bem definidas durante o desenvolvimento e uma vez que suas linhagens estejam completas, desaparecem. A altura em que os NBs desparecem difere consoante os subtipos de NBs e embora alguns dos mecanismos moleculares que levam a este desaparecimento já sejam conhecidos, como é o caso da apoptose ou autofagia, ainda não está claro a forma como esses mecanismos são coordenados temporalmente relativamente ao desenvolvimento cerebral. O Capítulo I desta tese, tem como foco os NBs do cérebro central, os quais desaparecem nos estadios iniciais de pupa. Sabe-se que a diferenciação terminal desses NBs é regulada, em parte, por um pulso da hormona ecdisona, no entanto, não se sabe se também existem fatores de transcrição temporais a regular este processo. Assim, para identificar possíveis fatores de transcrição responsáveis por regular o desaparecimento atempado dos NBs, selecionei um conjunto de candidatos e avaliei o impacto que diminuir a sua expressão tem nos NBs relativamente ao seu tempo de vida e proliferação. Apenas um destes candidatos, o TFIIFα, um membro da maquinaria de transcrição associada à RNA Polimerase II (PolII), provou ter um impacto no tempo de vida dos NBs, pois a diminuição de TFIIFα levou a que alguns NBs sobrevivessem em pupa durante mais tempo. Além disso, a diminuição dos níveis de TFIIFα em NBs também levou a defeitos na diferenciação de linhagem neuronal e na formação de células ectópicas semelhantes a NBs já em larva. Outros membros da maquinaria transcricional associada à RNA PolII, como o TFIIFβ, o TFIIB e o TFIIS, mostraram um fenótipo semelhante, indicando que a maquinaria transcricional pode desempenhar um papel importante na regulação das linhagens neuronais. No Capítulo II encontra-se descrita a criação de um atlas abrangente de sequenciação do transcriptoma de células individuais (scRNA-Seq), composto por 6 conjuntos de dados de menores dimensões, que vão desde os últimos estadios larvares até ao início da pupa. Este esforço teve como objetivo gerar um conjunto abrangente de dados transcricionais do cérebro em desenvolvimento de Drosophila, incluindo os vários estados de diferenciação dentro de uma linhagem neuronal. Este conjunto de dados inclui NBs do cérebro central e do cordão nervoso ventral, bem como as respetivas linhagens geradas dentro das janelas temporais sequenciais e restritas selecionadas. Para gerar estes dados, usei uma estratégia de marcação genética condicional, que permitiu incluir os NBs e toda a sua descendência até aos neurónios mais novos com menos de 12,5h. Embora a integração de todos os conjuntos de dados ainda não esteja concluída, este atlas representa um importante conjunto de informação para estudos futuros sobre uma grande variedade de questões biológicas, que vão desde a proliferação de NBs até à diferenciação neuronal. Por fim, no Capítulo III, foi selecionado um dos conjuntos de dados obtidos anteriormente, correspondente às 105h após a formação da larva, para estudar a diferenciação da linhagem de NBs, bem como a maturação neuronal. O objetivo desta análise consistiu em identificar fatores de transcrição que potencialmente estivessem a regular as transições entre as diferentes fases de diferenciação de uma linhagem de NBs. Curiosamente, foi identificado um estado de transição entre os NBs do tipo I e as suas células-filhas, as células-mãe ganglionares (GMCs), o qual designámos GMCs imaturas (imGMCs). Este estado de diferenciação transitório, parece ser suficientemente diferente a nível transcricional quer dos NBs quer das GMCs, de forma a permitir sua identificação independente; além disso, a presença de imGMCs mostra que a diferenciação de NBs para GMCs não é imediata, requerendo um período de transição. Ao comparar os diferentes estados de diferenciação celular de uma linhagem, pudemos identificar genes que são expressos diferencialmente em cada estado, o que os torna prováveis candidatos a desempenhar um papel importante na proliferação e diferenciação dos NBs. Além disso, o fato deste conjunto de dados incluir apenas neurónios muito jovens, permitiu o estudo das primeiras etapas da maturação neuronal. Os resultados revelaram que a maturação do neurónio começa rapidamente após a formação do mesmo e levaram à divisão do processo de maturação em 3 fases distintas com base na dinâmica transcricional de genes associados a características neuronais mais maturas, acompanhada ou não de tradução das mesmas. Consequentemente, a Fase 1 é composta por neurónios imaturos que ainda não começaram a expressar mRNA de características neuronais maturas; a Fase 2 inclui neurónios que começam a transcrever, mas não a traduzir marcadores de maturação, como genes associados a neurotransmissores; na Fase 3 da maturação neuronal, a qual é coordenada com o estadio de desenvolvimento do animal, existe expressão de mRNA, mas também de proteína, de características neuronais mais maturas. Em última análise, os resultados do trabalho apresentado nesta tese contribuíram para um melhor entendimento da progressão da linhagem neuronal e da maturação dos neurónios. Adicionalmente, os dados gerados neste estudo, representam um recurso válido e útil para a comunidade científica interessada no desenvolvimento cerebral e na diversidade neuronal.
ABSTRACT: A brain is formed from a small number of neural stem cells (NSCs), that give rise to the large neuronal diversity in the adult. For the brain to properly function it is important that the right neurons are generated at the right time. The Drosophila brain has proven to be a great model to understand how the brain develops; it contains a small set of NSCs, the neuroblasts (NBs), that generate invariable neuronal lineages in precise developmental windows, thus making it a perfect system to study the mechanisms of neural differentiation and cellular diversity. The transcriptional profile of NBs and their lineages are essential to specify the neuron type generated. After neurons are formed their neuronal terminal features, essential for neuron function, start being expressed and are maintained throughout neuron life. Thus, for proper brain development to occur, NBs must express the correct sequence and combination of transcription factors (TFs) throughout brain development. Moreover, the differentiation process from NB to neurons also needs to be tightly regulated so that the right neurons can be generated. Though many advances have been made in this area, the complete set of genes that regulates lineage progression is still not known, neither are the full set of mechanisms that lead to proper neuronal maturation and function. NBs divide to generate neural cells in very defined windows during development, and once their lineages are complete, they disappear. The timings for NB disappearance differ between NB sub-types, and although some of the molecular mechanisms that drive final disappearance, as apoptosis or autophagy are known, it is still unclear how these mechanisms are temporally coordinated with brain development. In Chapter I of this thesis, I focused on central brain (CB) NBs which disappear in early pupal stages. Terminal differentiation of these NBs is known to be regulated in part by a pulse of the hormone ecdysone, however, it is unknown if there are also temporal TFs fine tuning this process. Thus, to identify possible TF regulators of NB timely disappearance, I selected a set of candidates and assessed the impact that knocking them down in NBs had in their lifespan and proliferation. Only one of the tested candidates, TFIIFα, a member of the general RNA Polymerase II (PolII) transcriptional machinery, has proven to have an impact in NB lifespan, as TFIIFα knock down led to the presence of longer-lived pupal NBs. Moreover, down regulation of TFIIFα levels in NBs also led to defects in lineage differentiation and formation of ectopic NB-like cells already during larval stages. Other members of the RNA PolII transcriptional machinery such as TFIIFβ, TFIIB and TFIIS have shown a similar phenotype, ultimately indicating that the transcriptional machinery may play an important role in regulating NB lineages. In Chapter II, I describe the generation of a comprehensive single cell RNA sequencing (scRNA-Seq) atlas, composed of 6 smaller datasets ranging from late larval stages to early pupa. The goal of this effort was to generate a comprehensive pool of transcriptomic data of the developing Drosophila brain, comprising the several differentiation states within a NB lineage. These datasets include CB and ventral nerve cord (VNC) NBs and the respective lineages generated within restricted sequential temporal windows. To generate this data, I took advantage of a conditional genetic labeling strategy, that allowed to include NBs and their progeny, up until young neurons with less than 12.5h. Though, the full integration of all datasets is not completed yet, this atlas represents an important pool of information for future studies regarding a large variety of biological questions, from NB proliferation to differentiation. Finally, in Chapter III, we selected one of the previously obtained datasets, collected at 105h after larval hatching, in order to study NB lineage differentiation, as well as neuronal maturation. We aimed to identify TFs that might be regulating fate changes within a NB lineage differentiation process. Interestingly, we have identified a transition state between type I NBs and their daughter cells, the ganglion mother cells (GMCs), that we called immature GMCs (imGMCs). These transitory cell state, seems to be transcriptionally different enough from NBs and GMCs to allow its independent identification; moreover, it shows that the fate change between NBs to GMCs is not immediate, but requires a lag period. By comparing the different cell differentiation states within a lineage, we were able to identify genes that are differentially expressed at each state, which makes them likely candidates for playing an important role in NB proliferation and differentiation. Furthermore, the fact that these datasets only include very young neurons, allowed us to study the early steps of neuronal maturation. Our findings revealed that neuron maturation starts very quickly after neuron formation, and sub-divide the process of maturation into 3 distinct phases based on the dynamics of transcription with or without translation of mature neuronal features. Phase 1 is composed by immature neurons that have yet to start expressing mRNA of mature neuronal features; Phase 2 includes neurons that start transcribing but not translating maturation markers such as neurotransmitter genes; Phase 3 of neuron maturation, which is coordinated with the animal developmental stage, is when not only mRNA, but also the protein of more mature neuronal features is expressed. Ultimately, the findings resulting from the work presented in this thesis have contributed to a better understanding of neuronal lineage progression and neuronal maturation. Moreover, the data generated in this study, represents a valid and useful resource for the scientific community interested in brain development and neuronal diversity.
Topical name Brain
Neurons
Academic Dissertations
Index terms Universidade NOVA de Lisboa
NOVA Medical School
Tese de Doutoramento
Mecanismos de Doença e Medicina Regenerativa
2022
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Documento Eletrónico Biblioteca NMS|FCM
online
RUN http://hdl.handle.net/10362/137623 Available 20220102

RESUMO: O cérebro é formado por um pequeno número de células estaminais neuronais que dão origem à grande diversidade neuronal no adulto. Para que o cérebro funcione adequadamente, é importante que os neurónios certos sejam formados no momento certo. O cérebro de Drosophila provou ser um ótimo modelo para estudar o desenvolvimento cerebral pois contém um pequeno conjunto de células estaminais neuronais, os neuroblastos (NBs), que geram linhagens neuronais invariáveis ao longo de janelas de desenvolvimento precisas, tornando-se um sistema perfeito para estudar os mecanismos de diferenciação neuronal e diversidade celular. Os perfis transcricionais dos NBs e das suas linhagens são essenciais para especificar o tipo de neurónios formados. Depois dos neurónios serem formados, as suas características terminais neuronais, as quais são essenciais para o funcionamento do neurónio, começam a ser expressas e são mantidas ao longo da vida do neurónio. Assim, para que desenvolvimento cerebral ocorra corretamente, os NBs devem expressar a sequência e combinação corretas de fatores de transcrição ao longo do desenvolvimento do cérebro. Além disso, o processo de diferenciação desde os NBs até aos neurónios também precisa de ser regulado de forma precisa para que os neurónios certos possam ser formados. Embora muitos avanços tenham sido feitos nesta área, o conjunto completo de genes que regula a progressão da linhagem ainda não é conhecido, o mesmo acontece com o conjunto completo de mecanismos que levam a uma maturação e função neuronal adequadas. Os NBs dividem-se para gerar células neurais em janelas temporais bem definidas durante o desenvolvimento e uma vez que suas linhagens estejam completas, desaparecem. A altura em que os NBs desparecem difere consoante os subtipos de NBs e embora alguns dos mecanismos moleculares que levam a este desaparecimento já sejam conhecidos, como é o caso da apoptose ou autofagia, ainda não está claro a forma como esses mecanismos são coordenados temporalmente relativamente ao desenvolvimento cerebral. O Capítulo I desta tese, tem como foco os NBs do cérebro central, os quais desaparecem nos estadios iniciais de pupa. Sabe-se que a diferenciação terminal desses NBs é regulada, em parte, por um pulso da hormona ecdisona, no entanto, não se sabe se também existem fatores de transcrição temporais a regular este processo. Assim, para identificar possíveis fatores de transcrição responsáveis por regular o desaparecimento atempado dos NBs, selecionei um conjunto de candidatos e avaliei o impacto que diminuir a sua expressão tem nos NBs relativamente ao seu tempo de vida e proliferação. Apenas um destes candidatos, o TFIIFα, um membro da maquinaria de transcrição associada à RNA Polimerase II (PolII), provou ter um impacto no tempo de vida dos NBs, pois a diminuição de TFIIFα levou a que alguns NBs sobrevivessem em pupa durante mais tempo. Além disso, a diminuição dos níveis de TFIIFα em NBs também levou a defeitos na diferenciação de linhagem neuronal e na formação de células ectópicas semelhantes a NBs já em larva. Outros membros da maquinaria transcricional associada à RNA PolII, como o TFIIFβ, o TFIIB e o TFIIS, mostraram um fenótipo semelhante, indicando que a maquinaria transcricional pode desempenhar um papel importante na regulação das linhagens neuronais. No Capítulo II encontra-se descrita a criação de um atlas abrangente de sequenciação do transcriptoma de células individuais (scRNA-Seq), composto por 6 conjuntos de dados de menores dimensões, que vão desde os últimos estadios larvares até ao início da pupa. Este esforço teve como objetivo gerar um conjunto abrangente de dados transcricionais do cérebro em desenvolvimento de Drosophila, incluindo os vários estados de diferenciação dentro de uma linhagem neuronal. Este conjunto de dados inclui NBs do cérebro central e do cordão nervoso ventral, bem como as respetivas linhagens geradas dentro das janelas temporais sequenciais e restritas selecionadas. Para gerar estes dados, usei uma estratégia de marcação genética condicional, que permitiu incluir os NBs e toda a sua descendência até aos neurónios mais novos com menos de 12,5h. Embora a integração de todos os conjuntos de dados ainda não esteja concluída, este atlas representa um importante conjunto de informação para estudos futuros sobre uma grande variedade de questões biológicas, que vão desde a proliferação de NBs até à diferenciação neuronal. Por fim, no Capítulo III, foi selecionado um dos conjuntos de dados obtidos anteriormente, correspondente às 105h após a formação da larva, para estudar a diferenciação da linhagem de NBs, bem como a maturação neuronal. O objetivo desta análise consistiu em identificar fatores de transcrição que potencialmente estivessem a regular as transições entre as diferentes fases de diferenciação de uma linhagem de NBs. Curiosamente, foi identificado um estado de transição entre os NBs do tipo I e as suas células-filhas, as células-mãe ganglionares (GMCs), o qual designámos GMCs imaturas (imGMCs). Este estado de diferenciação transitório, parece ser suficientemente diferente a nível transcricional quer dos NBs quer das GMCs, de forma a permitir sua identificação independente; além disso, a presença de imGMCs mostra que a diferenciação de NBs para GMCs não é imediata, requerendo um período de transição. Ao comparar os diferentes estados de diferenciação celular de uma linhagem, pudemos identificar genes que são expressos diferencialmente em cada estado, o que os torna prováveis candidatos a desempenhar um papel importante na proliferação e diferenciação dos NBs. Além disso, o fato deste conjunto de dados incluir apenas neurónios muito jovens, permitiu o estudo das primeiras etapas da maturação neuronal. Os resultados revelaram que a maturação do neurónio começa rapidamente após a formação do mesmo e levaram à divisão do processo de maturação em 3 fases distintas com base na dinâmica transcricional de genes associados a características neuronais mais maturas, acompanhada ou não de tradução das mesmas. Consequentemente, a Fase 1 é composta por neurónios imaturos que ainda não começaram a expressar mRNA de características neuronais maturas; a Fase 2 inclui neurónios que começam a transcrever, mas não a traduzir marcadores de maturação, como genes associados a neurotransmissores; na Fase 3 da maturação neuronal, a qual é coordenada com o estadio de desenvolvimento do animal, existe expressão de mRNA, mas também de proteína, de características neuronais mais maturas. Em última análise, os resultados do trabalho apresentado nesta tese contribuíram para um melhor entendimento da progressão da linhagem neuronal e da maturação dos neurónios. Adicionalmente, os dados gerados neste estudo, representam um recurso válido e útil para a comunidade científica interessada no desenvolvimento cerebral e na diversidade neuronal.

ABSTRACT: A brain is formed from a small number of neural stem cells (NSCs), that give rise to the large neuronal diversity in the adult. For the brain to properly function it is important that the right neurons are generated at the right time. The Drosophila brain has proven to be a great model to understand how the brain develops; it contains a small set of NSCs, the neuroblasts (NBs), that generate invariable neuronal lineages in precise developmental windows, thus making it a perfect system to study the mechanisms of neural differentiation and cellular diversity. The transcriptional profile of NBs and their lineages are essential to specify the neuron type generated. After neurons are formed their neuronal terminal features, essential for neuron function, start being expressed and are maintained throughout neuron life. Thus, for proper brain development to occur, NBs must express the correct sequence and combination of transcription factors (TFs) throughout brain development. Moreover, the differentiation process from NB to neurons also needs to be tightly regulated so that the right neurons can be generated. Though many advances have been made in this area, the complete set of genes that regulates lineage progression is still not known, neither are the full set of mechanisms that lead to proper neuronal maturation and function. NBs divide to generate neural cells in very defined windows during development, and once their lineages are complete, they disappear. The timings for NB disappearance differ between NB sub-types, and although some of the molecular mechanisms that drive final disappearance, as apoptosis or autophagy are known, it is still unclear how these mechanisms are temporally coordinated with brain development. In Chapter I of this thesis, I focused on central brain (CB) NBs which disappear in early pupal stages. Terminal differentiation of these NBs is known to be regulated in part by a pulse of the hormone ecdysone, however, it is unknown if there are also temporal TFs fine tuning this process. Thus, to identify possible TF regulators of NB timely disappearance, I selected a set of candidates and assessed the impact that knocking them down in NBs had in their lifespan and proliferation. Only one of the tested candidates, TFIIFα, a member of the general RNA Polymerase II (PolII) transcriptional machinery, has proven to have an impact in NB lifespan, as TFIIFα knock down led to the presence of longer-lived pupal NBs. Moreover, down regulation of TFIIFα levels in NBs also led to defects in lineage differentiation and formation of ectopic NB-like cells already during larval stages. Other members of the RNA PolII transcriptional machinery such as TFIIFβ, TFIIB and TFIIS have shown a similar phenotype, ultimately indicating that the transcriptional machinery may play an important role in regulating NB lineages. In Chapter II, I describe the generation of a comprehensive single cell RNA sequencing (scRNA-Seq) atlas, composed of 6 smaller datasets ranging from late larval stages to early pupa. The goal of this effort was to generate a comprehensive pool of transcriptomic data of the developing Drosophila brain, comprising the several differentiation states within a NB lineage. These datasets include CB and ventral nerve cord (VNC) NBs and the respective lineages generated within restricted sequential temporal windows. To generate this data, I took advantage of a conditional genetic labeling strategy, that allowed to include NBs and their progeny, up until young neurons with less than 12.5h. Though, the full integration of all datasets is not completed yet, this atlas represents an important pool of information for future studies regarding a large variety of biological questions, from NB proliferation to differentiation. Finally, in Chapter III, we selected one of the previously obtained datasets, collected at 105h after larval hatching, in order to study NB lineage differentiation, as well as neuronal maturation. We aimed to identify TFs that might be regulating fate changes within a NB lineage differentiation process. Interestingly, we have identified a transition state between type I NBs and their daughter cells, the ganglion mother cells (GMCs), that we called immature GMCs (imGMCs). These transitory cell state, seems to be transcriptionally different enough from NBs and GMCs to allow its independent identification; moreover, it shows that the fate change between NBs to GMCs is not immediate, but requires a lag period. By comparing the different cell differentiation states within a lineage, we were able to identify genes that are differentially expressed at each state, which makes them likely candidates for playing an important role in NB proliferation and differentiation. Furthermore, the fact that these datasets only include very young neurons, allowed us to study the early steps of neuronal maturation. Our findings revealed that neuron maturation starts very quickly after neuron formation, and sub-divide the process of maturation into 3 distinct phases based on the dynamics of transcription with or without translation of mature neuronal features. Phase 1 is composed by immature neurons that have yet to start expressing mRNA of mature neuronal features; Phase 2 includes neurons that start transcribing but not translating maturation markers such as neurotransmitter genes; Phase 3 of neuron maturation, which is coordinated with the animal developmental stage, is when not only mRNA, but also the protein of more mature neuronal features is expressed. Ultimately, the findings resulting from the work presented in this thesis have contributed to a better understanding of neuronal lineage progression and neuronal maturation. Moreover, the data generated in this study, represents a valid and useful resource for the scientific community interested in brain development and neuronal diversity.

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