Tese de Doutoramento Ciências da Saúde 2023 Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa

Breast cancer (BC) is the most frequent type of cancer and the leading cause of cancer related deaths in women. In recent years, the improvement in diagnosis techniques and consequent earlier detection of the disease led to a decline in the mortality from BC in developed countries. Furthermore, the development of more efficient therapies contributed for the reduction of the number of fatalities from this type of cancer. However, BC is still a major health issue, in which the formation of metastasis accounts for most BC-related deaths. Therefore, the development of therapies to impair metastasis is essential to reduce mortality and morbidity. To achieve this goal, it is paramount to understand the mechanisms underlying the progression from normal breast cells to breast carcinoma in situ and to invasive BC. Emerging evidence indicates that membrane traffic is subverted by cancer cells to acquire proliferative, migratory, and invasive capacities. Indeed, members of the ADP-ribosylation factor (Arf) family, whcih regulate several steps of membrane traffic, have been shown to be upregulated in several malignancies and promote cancer progression. Furthermore, our group revealed that a member of the Arf-like (Arl) subfamily - ARL13B - regulates BC cell migration and invasion. This protein regulates primary cilia functions, although it also has been shown to regulate processes outside the cilia, including focal adhesion (FA) dynamics and the formation of circular dorsal ruffles (CDRs). However, the role of other ARLs in BC progression is still poorly understood. Therefore, the main aim of this PhD work was to identify new players in BC progression. We focused on the ARL subfamily of proteins, to unravel the underlying mechanisms that promote BC tumorigenic features, which can be targeted to impair tumor progression and the formation of metastases. The results obtained in this work show that several ARL genes are upregulated in BC cell lines, namely ARL1, ARL2, ARL3, ARL4A, ARL5A, ARL5B, ARL6, ARL8A, ARL8B, ARL11, ARL13B, ARL14 and ARFRP1. Furthermore, a bioinformatic analysis using BC samples and normal adjacent tissues from the TCGA dataset revealed that ARL1, ARL8B, ARL11 and ARFRP1 are upregulated in BC. Moreover, we found that ARFRP1 regulates BC cell migration and invasion. This protein controls the transport of molecules at the trans-Golgi network (TGN) and was found to be important for the transport of proteins that are involved in cell-cell adhesion and planar cell polarity, which are involved in cell migration and invasion. We also found that ARL13B impairs the invasion of highly invasive BC cells using a 3D system, namely spheroids. Finally, our study revealed that the lysosomal transport regulators ARL8A and ARL8B impair BC cell migration and ARL8B silencing decreases cell invasion in 3D and lysosome exocytosis in BC cells. In the future, it would be important to investigate the signaling pathways involved in the regulation of BC migration and invasion promoted by ARFRP1. Furthermore, we previously proposed that ARL13B regulates BC cell migration and invasion through a cilia-independent mechanism likely mediated the non-canonical Sonic hedgehog (Shh) pathway. Future experiments to validate this hypothesis are necessary. ARL8A and ARL8B have been shown to regulate the movement of lysosomes to the cell periphery, although recent studies have shown that these proteins can also regulate the anterograde movement of endolysosomes. So, in future experiments it would be important to address what pathways are at play in the regulation of BC cell migration and invasion by ARL8A and ARL8B. In conclusion, this work strongly suggests that ARFRP1, ARL13B, and ARL8 proteins could potentially serve as therapeutic targets to impair BC progression and reduce the high mortality and morbidity associated with this disease. Furthermore, the results obtained with this study reinforce the notion that membrane traffic regulators can be subverted by cancer cells, including BC cells, to promote migration and invasion. Thus, it highlights the importance of considering these proteins and the mechanisms regulated by them as targets for the design of new therapies for BC.

O cancro de mama (CM) é o tipo de cancro mais frequente e a principal causa de morte associada ao cancro, em mulheres. Nos últimos anos, a melhoria das técnicas de diagnóstico e a consequente deteção mais precoce da doença levaram ao declínio da mortalidade por CM nos países desenvolvidos. Além disso, o desenvolvimento de terapias mais eficientes contribuiu para a redução do número de óbitos. No entanto, o CM ainda constitui um problema de saúde grave, no qual a formação de metástases é responsável pela maioria das mortes. Portanto, o desenvolvimento de terapias para impedir a formação de metástases é essencial para reduzir a mortalidade e a morbilidade. Para atingir este objetivo, é necessária a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à progressão de células mamárias normais para células de carcinoma de mama in situ e de carcinoma de mama invasivo. Vários estudos sugerem que o tráfego de membranas é subvertido por células cancerígenas para que estas adquiriram capacidades proliferativas, migratórias e invasivas. De facto, foi demonstrado que membros da família de fatores de ribosilação do ADP (Arf), que regulam várias etapas do tráfego de membranas, estão sobrexpressos em diferentes tipos de cancro e promovem a progressão desta doença. Além disso, o nosso grupo demonstrou que um membro da subfamília de proteínas Arf-like (Arls) - ARL13B - regula a migração e invasão de células de CM. Esta proteína regula mecanismos nos cílios primários, embora também regule processos fora dos cílios, incluindo a dinâmica de adesões focais e a formação de circular dorsal ruffles. No entanto, o papel de outras Arls na progressão do CM ainda é mal compreendido. Portanto, o principal objetivo deste trabalho de doutoramento foi identificar novos reguladores da progressão de CM, com foco na subfamília de proteínas Arl. Com isto, pretendemos desvendar os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento desta doença e descobrir potenciais alvos terapêuticos para impedir a progressão do tumor e a formação de metástases. Os resultados obtidos neste trabalho mostram que vários genes ARL estão sobrexpressos em linhas celulares de CM, nomeadamente ARL1, ARL2, ARL3, ARL4A, ARL5A, ARL5B, ARL6, ARL8A, ARL8B, ARL11, ARL13B, ARL14 e ARFRP1. Além disso, uma análise bioinformática usando a base de dados TCGA, que inclui amostras de CM e tecidos adjacentes normais mamários, revelou que os genes ARL1, ARL8B, ARL11 e ARFRP1 estão sobrexpressos em CM. Adicionalmente, descobrimos que a proteína ARFRP1 regula a migração e invasão de células de CM. Esta proteína regula o transporte de moléculas na rede trans-Golgi e regula o transporte de proteínas que estão envolvidas em adesões célula-célula e na polaridade celular planar, processos que estão associados à migração e invasão celular. Também descobrimos que a ARL13B regula a invasão de células de CM altamente invasivas em 3D. Por fim, este estudo revelou que os reguladores de transporte de lisossomas, ARL8A e ARL8B, regulam a migração de células de CM e que o silenciamento da ARL8B diminui a invasão de células em 3D e a exocitose de lisossomas em células de CM. No futuro, seria importante investigar quais as vias de sinalização envolvidas na regulação da migração e invasão de CM promovidas pela ARFRP1. Além disso, propusemos anteriormente que a AR13B regula a migração e invasão de células de CM, através de um mecanismo independente de cílios, potencialmente mediado pela via não canónica do Sonic hedgehog. Portanto, será importante realizar futuras experiências para validar esta hipótese. As proteínas ARL8A e ARL8B foram demonstradas regular o movimento dos lisossomas para a periferia da célula, embora estudos recentes tenham demonstrado que também podem regular o movimento anterógrado de endolisossomas. Assim, no futuro, seria importante abordar que vias, mediadas pelas proteínas ARL8A e ARL8B, regulam a migração e invasão de células de CM. Em conclusão, este trabalho sugere que as proteínas ARFRP1, ARL13B e ARL8 podem ser potenciais alvos terapêuticos para impedir a progressão do CM e reduzir a alta mortalidade e morbilidade associadas a esta doença. Além disso, os resultados obtidos com este estudo reforçam a noção de que os reguladores de tráfego de membrana podem ser subvertidos por células cancerígenas, incluindo células de CM, para migrar e invadir. Estas evidências demonstram a importância de considerar estas proteínas e os mecanismos moleculares associados como alvos para o desenho de novas terapias para o tratamento do CM.

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