Dissertação de Mestrado Investigação Biomédica 2023 Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa

Abstract: Pancreas cancer, namely, pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), is the 7th leading cause of cancer-related deaths worldwide. Treatment options for patients with PDAC are still limited, with the only therapeutic option being surgical resection in combination with chemotherapy. Most patients with PDAC are diagnosed during an advanced stage of the disease, where surgery is not an option, yet chemotherapy remains a viable treatment modality. Immunotherapy for patients with PDAC does not have a place in standard clinical treatment protocols, except for patients (about 1% of patients with PDAC) with mismatch repair gene defects and a high mutational burden. Adoptive cellular therapies, i.e. tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) or transgenic T-cells (i.e. CAR-T-cells) have been used for a very reduced number of patients with PDAC in a few international centers. One of the hallmarks of PDAC is the immunosuppressive tumor-microenvironment (TME) that contributes to the limited clinical success of patients with PDAC receiving immunotherapy. There is therefore an unmet need to i) better understand the TME and to ii) improve the selective expansion of tumor-specific T-cells capable of killing cancer cells – even in an adverse TME. We studied here the role of sphingolipids, crucial components for cell membrane integrity, structure and function as well as T-cell activation. Sphingolipids exhibit a core composition of a sphingoid base – sphingosine, which is a fatty amino alcohol with 18 carbon atoms –that results in the formation of polar lipid mediators. Sphingosine-1-phosphate (S1P) is a derivative of this sphingolipids with as yet ill-defined bioactive mediator functions in the immune system. S1P can be recognized by a G-protein coupled receptor family (S1PR1-5), that signals in an extracellular or intracellular manner. S1P signaling is involved in several, complex cellular processes, such as regulation of cell types or cytokine production; compounds binding to the S1PR have been approved for the therapy of patients with multiple sclerosis, underling the critical role of S1PR mediating signaling in immunopathology. S1P serves also as a predictive biomarker associated with favorable or unfavorable clinical prognosis for patients with cancer, associated with tumor histology. Based on the unmet need to better understand the TME in patients with PDAC and to favor a tumor-specific, Th1-type (IFN-gamma) driven T-cell response, we analyzed the biological effects of S1P compounds in association with their well – described binding to the nominal S1P-receptor, on T-cell function, defined by cytokine production and T-cell differentiation/maturation and tissue homing capacity, defined by flow-cytometry. A pilot study was conducted in order to determine the optimal concentration of a panel of S1PR1-binding molecules, i.e. A97132, Cerafilimod, CS2100, CYM5541, CYM5542, Ex26, GSK2018682, RP001, S1P, SEW2871, TC-G1006, TC-SP14, TY2156, VPC23019, W146. These compounds were tested for the capacity to induce interferon gamma (IFN-ү) and interleukin 17 isoform A (IL-17A) protein in immune cells in a screening process. Four compounds (Cerafilimod, GSK2018682, S1P, W146) were then used to test peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or TILs from patients with pancreatic or gastrointestinal cancers for T-cell function and maturation. Different molecularly defined S1P compound analogues exhibited distinct biological effects. The main findings of this study being 1) an increase of the frequency of central memory T-cell population in TILs upon stimulation with the natural S1P agonist and a human anti-CD3 antibody and 2) the upregulation of CD3 protein expression on the cell surface upon S1P stimulation. Both findings constitute viable features for improved T-cell function in an adverse TME. These data constitute first evidence that the S1P/S1PR1 signaling axis could be employed for boosting T-cell function in future immunotherapeutic approaches.

Resumo: O cancro do pâncreas, nomeadamente o adenocarcinoma do ducto pancreático (PDAC), é a 7ª maior causa de mortes relacionadas com cancro a nível mundial. As opções de tratamento são limitadas, sendo a mais comum a remoção cirúrgica em combinação com quimioterapia. No entanto, a maioria dos pacientes é diagnosticado num estado avançado da doença, em que a cirurgia já não é uma opção viável, deixando apenas a quimioterapia como única alternativa. A imunoterapia ainda não constitui um tratamento padrão, exceto para pacientes (cerca de 1% no caso de PDAC) com defeitos genéticos do tipo mismatch repair ou com cargas mutacionais altas. Em alguns centros internacionais, terapias celulares adotivas, como linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) ou células T transgénicas foram administradas a um número restrito de pacientes. Uma das caractéristicas distintas do PDAC é o seu microambiente tumoral (TME) altamente imunossupressor, que contribui para a parca eficácia clínica das imunoterapias utilizadas. Existe portanto a necessidade de: 1) compreender melhor o TME, e 2) melhorar a expansão seletiva de células T específicas que reconhecem o tumor e capazes de matar as células tumorais mesmo num TME adverso. Neste estudo, foi explorado o papel dos esfingolípidos, componentes cruciais à integridade, estrutura e função das membranes celulares, bem como à ativação de células T. Os esfingolípidos apresentam uma composição base de esfingosina (um aminoálcool com 18 átomos de carbono) que forma intermediários lipídicos polares. A esfingosina-1-fosfato (S1P) é um desses metabolitos, exibindo funções de intermediário bioactivo no sistema imune, apesar de pouco definidas. A S1P pode ser reconhecida por uma família de recetores acoplados à proteína G (S1PR1-5), que sinaliza de forma extracelular e/ou intracelular. Esta sinalização está envolvida em vários processos celulares complexos, tais como a regulação de linhagem celulares e produção de citoquinas. Compostos moduladores de S1P foram aprovados em contextos clínicos em pacientes com esclerose múltipla, o que reforça o papel crítico desta sinalização em imunopatologias. A S1P é também um biomarcador associado a prognósticos clínicos em pacientes com cancro, podendo ser favorável ou desfavorável dependendo da sua histologia. Baseado na necessidade de compreender melhor o microambiente tumoral do PDAC, e favorecer respostas celulares do tipo Th1 (interferão gama), foram analisados por citometria de fluxo, os efeitos biológicos de compostos associados com o S1P e o seu recetor S1PR1, na função das células T, definida por produção de citoquinas, diferenciação/maturação e capacidade de retornar ao tecido. Foi estabelecido um estudo piloto para a determinação da concentração ideal de um painel de compostos relacionados com o S1PR1 (A97132, Cerafilimod, CS2100, CYM5541, CYM5542, Ex26, GSK2018682, RP001, S1P, SEW2871, TC-G1006, TC-SP14, TY2156, VPC23019, W146). Estes compostos foram testados quanto à sua capacidade de induzir a produção de interferão gama e interleuquina 17 isoforma A (IL-17A) em células imunes, como forma de triagem. Foram selecionados e testados quatro compostos (Cerafilimod, GSK2018682, S1P, W146) quanto à função e maturação das células T, em células mononucleares de sangue periférico e TILs, em pacientes com cancro pancreático ou gástrico-intestinal. Diferentes compostos análogos à S1P provocaram efeitos biológicos distintos. As principais observações deste estudo são 1) o aumento da frequência da população de células de memória central em TILs após estimulação com o agonista endógeno S1P e com anti-CD3 humano; e 2) a regulação de feedback positivo da proteína CD3 na superfície da células após estimulação com S1P. Ambas as observações constituem características essenciais para uma função aprimorada das células T num TME adverso. Em resumo, estes dados constituem a primeira evidência de que o eixo de sinalização do S1P / S1PR pode ser utilizado para potenciar a função das células T em abordagens futuras de imunoterapia.