Tese de Doutoramento Mecanismos de Doença e Medicina Regenerativa 2023 Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa

Abstract: Cerberus-like 2, currently designated DAN domain BMP antagonist family member 5 (Dand5), is a secreted molecule that serves as antagonist to Nodal/TGF-β and Wnt pathways. During development, this molecule has been reported as being crucial in establishing left-right (LR) body asymmetry. In a knockout (KO) mouse model, the depletion of this molecule lead to randomization of the LR asymmetry. Moreover, myocardial hyperplasia was also observed, independently of randomization defects. Prolonged Nodal/TGF- β signalling was indicated to be behind the thickening of myocardial walls, due to an increase in the mitotic index during embryonic development. These results point out that DAND5 can also modulate cardiogenesis. As such, from the KO mouse model, mouse embryonic stem cells (mESCs) were derived and, using the embryoid body (EB) differentiation approach, used to study DAND5’s possible role in cardiomyocyte differentiation. EBs allow spontaneous differentiation of mESCs, and resembles early embryonic development, serving as a window to the molecular and cellular processes of that period. Dand5 KO EBs recapitulate the in vivo results, with cardiac features emerging first than in wild type (WT) EBs. Spontaneous contractile clusters, termed beating foci, appear in WT EBs around days 7-8 of differentiation, while in KO EBs these features appear earlier, at days 6-7. Furthermore, KO EBs also display earlier expression of mesoderm and cardiac genes, such as Brachyury and Nkx2.5; more α-actinin staining with better sarcomere organisation; and higher number of cardiac progenitors. All in all, depletion of DAND5 during EB differentiation enhances cardiac differentiation, by inducing mesoderm and activating cardiogenic genes earlier. In the work developed for this thesis, these results were further substantiated by a subsequent RNA sequencing (RNAseq) dataset comprising data from both WT and KO EBs at various timepoints of the differentiation, that showed the same genetic expression trend. For example, genes encoding cardiac cells calcium channels (e.g., Cacnb2) or sarcomeric proteins (e.g., Tnnt2 or Myh6), were expressed earlier in KO EBs. The RNAseq data provided a widened view into the changes resulting from DAND5’s absence, showing that, overall, KO EBs progress faster through differentiation. The differences in expression will lead to differences in expression of genes involved with Notch and Wnt signalling pathways, as well as changes in expression of genes encoding membrane proteins (e.g., Itb3, an integrin subunit). These distinct expression profiles will fundamentally alter cellular signalling and how cells interact with their microenvironment. Wnt and Notch pathways have been involved in inducing and controlling epithelial to mesenchymal transition (EMT), a cellular process that transforms tightly packed cells, changing their cytoskeleton, cell-cell, and cell-extracellular matrix (ECM) contacts, and genetic expression, culminating in acquisition of migratory potential. Bearing this in mind, and the RNAseq results showing disruption of EMT-related pathways, WT and KO EBs were studied regarding migration, genetic expression of EMT transcription factors (TFs) and membrane proteins, and presence of focal adhesions (FAs). Phenotypically, KO EBs show lower migration rates, with higher FA contents, denoting a stronger attachment to the substrate. As for EMT TFs and membrane proteins expression, the absence of DAND5 anticipates their expression. One of the hallmarks of in vivo EMT processes is heart valve development, specifically termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). After an upregulation of ECM production at prospective valve sites, cells of the lining endocardium are patterned by Notch and BMP signalling pathways to enter EndMT. These cells, upon completing EndMT, will migrate into the ECM cushions, proliferate, and organize themselves into different layers, accordingly to the mechanical requisites of heart valves. The four heart valves will prevent retrograde flow within the heart, ensuring proper blood pumping. Given the in vitro results and the in vivo importance of EndMT, Dand5 KO mice were screened for valve defects that could be correlated with the in vitro alterations in EMT. Dand5 expression during valve development locates to the myocardium, also the source of patterning BMP signal, and KO mice harbour valve morphological defects, namely inversion of the leaflets, which can compromise their function. This thesis provides evidence that DAND5 range of action goes beyond early development. Its absence leads to significantly different expression patterns in vitro, as well as defects in EMT and migration. In line with these results, in vivo depletion of DAND5 influences heart valve development, causing leaflet inversion. Understanding the influence of DAND5 in EMT and cell transformation allows further understanding of its role in development, or even in some disease contexts, such as congenital heart defects.

Resumo: Cerberus-like 2, atualmente denominado DAN domain BMP antagonist family member 5 (Dand5), é uma proteína extracelular cuja função é antagonizar várias vias de sinalização celular, como Nodal/TGF-β e Wnt. Estudos prévios associaram esta proteína ao correto estabelecimento da assimetria esquerdadireita na organização dos órgãos do tronco durante o desenvolvimento embrionário. Num modelo de ratinho em que o gene Dand5 foi substituído, levando à sua ausência (Dand5 KO, do inglês knockout), observou-se uma aleatorização da organização de órgãos como o coração, os pulmões, ou o estômago. Para além desses defeitos, e independentemente dos mesmos, ratinhos Dand5 KO apresentavam hiperplasia do miocárdio, resultante do prolongamento da via de sinalização Nodal/TGF-β, que por sua vez causa um aumento do índice mitótico das células cardíacas durante o desenvolvimento embrionário. Estes resultados indicaram que o papel de Dand5 podia ir além da correta organização do plano corporal, e foram o ponto de partida para uma estratégia in vitro que permitisse compreendê-los melhor. Obtiveram-se células estaminais pluripotentes com e sem o gene Dand5, wild type (WT) e KO, respetivamente. Recorrendo a estas células, desenhou-se uma experiência de diferenciação de corpos embrióides (embryoid bodies, EBs, em inglês), que permite obter espontaneamente todos os tipos de células do organismo. Esta estratégia de diferenciação de células pluripotentes recapitula alguns eventos moleculares e celulares do desenvolvimento embrionário. Os EBs KO reproduziram in vitro os resultados obtidos in vivo, demonstrando uma diferenciação cardíaca antecipada. A presença de zonas espontaneamente contrácteis em EBs WT é notória por volta dos dias 7-8 do processo de diferenciação, enquanto em EBs KO estas zonas surgem mais cedo, por volta dos dias 67. Para além destas características fenotípicas, os EBs KO também expressam mais cedo genes associados com a mesoderme e o desenvolvimento cardíaco, como Brachyury ou Nkx2.5; produzem maiores quantidades de α- actinina, com uma organização melhorada; e dão origem a um maior número de progenitores cardíacos. No trabalho desenvolvido para esta tese, estes resultados foram complementados com uma experiência de sequenciação de RNA (RNAseq), que incluiu amostras de ambos tipos de EB a diferentes alturas do processo de diferenciação. Estes resultados de expressão genética recapitularam a antecipação de expressão de genes envolvidos na cardiogénese. Entre os genes expressos antecipadamente encontravam-se genes codificando canais de cálcio cardíacos (e.g., Cacnb2), proteínas sarcoméricas (e.g., Tnnt2 ou Myh6). Os resultados da análise RNAseq permitiram alargar a análise dos efeitos decorrentes da ausência de DAND5 durante a diferenciação de EBs, mostrando que os EBs KO diferenciam mais rápido que os WT. Mais especificamente, os distintos perfis de expressão conduzem a diferente expressão de genes envolvidos nas vias Notch e Wnt, tal como genes que codificam proteínas membranares (e.g., Itgb3, uma subunidade de integrina). As diferenças em termos de expressão vão alterar fundamentalmente as vias de sinalização e a maneira como as células interagem com a sua envolvência. As vias de sinalização Wnt e Notch foram reportadas como induzindo e controlando a transição epitélio para mesenquima (EMT, do inglês epitelial to mesenchymal transition), um processo celular que permite que células epiteliais, organizadas estaticamente em camadas compactas, sofram alterações do citoesqueleto, dos seus pontos de contacto com outras células e com a matriz extracelular (ECM, do inglês extracelular matrix), e da sua expressão genética. Todas estas alterações irão alterar o fenótipo das células e permitir que estas migrem. Tendo isto em consideração, e os resultados da análise RNAseq que demonstram alterações nas vias Notch e Wnt, estudaram-se defeitos de migração, expressão genética de genes relacionados com a EMT, e a presença de adesões focais em EBs WT e KO. Fenotipicamente, EBs KO migram menos, e têm mais adesões focais, denotando uma maior adesão ao substrato. Já a expressão genética de genes encarregues de induzir e controlar a EMT, observou-se uma antecipação da sua expressão em EBs KO.