Tese de Doutoramento Mecanismos de Doença e Medicina Regenerativa 2023 Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa

Abstract: Breast cancer is the most frequent type of cancer worldwide and the leading cause of cancer-related deaths in women. Although the mortality from breast cancer in developed countries has declined in recent years, due to early detection and advances in adjuvant therapy, metastasis remains by far the main cause of mortality in breast cancer patients. Therefore, the development of therapies to impair metastasis and the identification of biomarkers that predict breast cancer progression is essential to reduce patient mortality. This goal requires an understanding of the molecular mechanisms that regulate not only the progression from ductal carcinoma in situ (DCIS) to invasive ductal carcinoma (IDC) but also subsequent cancer cell invasion. To be able to invade and form metastases, cancer cells subvert a wide range of cellular processes that enable them to adapt and overcome the micro-environmental barriers. Accumulating evidence suggests that membrane traffic is subverted by cancer cells to increase their proliferative, migratory and invasive capacities. Rab GTPases are key regulators of all steps of membrane traffic and were found to be dysregulated in several types of cancer and implicated in various aspects of tumor progression. Among the different Rabs, RAB11 subfamily has been shown to regulate vesicular trafficking by mediating transport of cargo from the endocytic recycling compartment to the trans-Golgi network and to the plasma membrane through recycling pathways. Interestingly, RAB11 isoforms (RAB11A, RAB11B and RAB25) have been associated with multiple biological processes of malignant tumors and poor prognosis. RAB25 is the most studied isoform in breast cancer, in which it has been shown to act as a tumor promoter or tumor suppressor depending on the molecular context. However, in contrast to the functions of RAB25, the role of RAB11A and RAB11B in breast cancer progression is still poorly understood. Therefore, the main objective of this PhD thesis was to determine the role of RAB11A and RAB11B in breast carcinogenesis and identify the underlying molecular mechanisms driving breast cancer progression. The results obtained in this work show that RAB11A mRNA levels are increased in breast cancer patient samples, comparing with paired adjacent tissues. Moreover, increased levels of RAB11A and RAB11B are positively correlated with the invasive capacity of different breast cancer cell lines. We observed that overexpression of RAB11 isoforms does not promote invasion in an in situ breast cancer spheroid model. Nevertheless, RAB11A enhances the proliferation of in situ breast cancer cells, suggesting that this isoform plays an important role during the early stages of breast cancer formation. Even though RAB11A and RAB11B do not mediate the transition from DCIS to IDC, we show that downregulation of each isoform inhibits proliferation as well as single and collective migration in a highly invasive triple-negative breast cancer cell line. In addition, RAB11A and RAB11B silencing impairs invasion in a breast cancer spheroid model of this cell line. Notably, RAB11 isoforms were shown to regulate the formation and activity of invadopodia, which are structures involved in the proteolytic degradation of the extracellular matrix. Interestingly, RAB11A and RAB11B regulate epithelial-mesenchymal transition by modulating the mRNA levels of SNAIL and SLUG. Finally, we also observed a decrease in the activation of the PI3K/AKT signaling pathway, upon downregulation of each isoform. It has been shown that invadopodia are necessary for cancer cell intravasation and extravasation during the metastatic cascade. Therefore, targeting the mechanisms that promote invadopodia formation and activity is regarded as a promising strategy to impair the development of metastases at any stage. Thus, we propose RAB11A and RAB11B as potential therapeutic targets to impair the formation of metastases.

Resumo: O cancro da mama é o tipo de tumor mais frequente a nível mundial e é a principal causa de morte associada a cancro em mulheres. Embora a mortalidade causada pelo cancro da mama tenha decrescido nos últimos anos, devido à deteção precoce da doença e aos avanços no seu tratamento, a metastização continua a ser a principal causa de morte nestas doentes. Por este motivo, o desenvolvimento de terapias para prevenção da metastização e a identificação de biomarcadores capazes de prever a progressão do cancro da mama são fundamentais para reduzir a mortalidade associada a esta doença. Para cumprir este objetivo, é necessário não só compreender os mecanismos moleculares que regulam a progressão do carcinoma ductal in situ (CDIS) não-invasivo para o carcinoma ductal invasivo (CDI) da mama, mas também a subsequente invasão de células cancerígenas. Para poder invadir e formar metástases, as células cancerígenas subvertem uma ampla série de processos celulares que lhes permite ultrapassar uma sucessão de barreiras biológicas. Vários estudos sugerem que o tráfego intracelular é subvertido pelas células cancerígenas para aumentar as suas capacidades proliferativas, migratórias e invasivas. As proteínas Rab GTPases estão envolvidas em todas as etapas do tráfego intracelular e a sua expressão encontra-se frequentemente alterada em vários tipos de cancro, estando implicadas em vários aspetos da progressão tumoral. Entre as diferentes Rabs, a subfamília RAB11 regula o tráfego intracelular através do transporte vesicular desde os endossomas de reciclagem para o aparelho de Golgi assim como para a membrana plasmática através de vias de reciclagem. Curiosamente, as isoformas da subfamília RAB11 (RAB11A, RAB11B e RAB25) têm sido associadas a múltiplos processos biológicos em tumores malignos e também a um pior prognóstico. No entanto, contrariamente às funções da RAB25, o papel da RAB11A e RAB11B na progressão do cancro da mama é ainda pouco conhecido. Portanto, o principal objetivo desta tese de doutoramento foi determinar o papel da RAB11A e RAB11B na formação e desenvolvimento do cancro de mama e identificar os mecanismos moleculares subjacentes à progressão desta doença. Os resultados obtidos neste trabalho mostram que os níveis de mRNA de RAB11A estão aumentados em amostras de pacientes com CDI, em comparação com tecidos adjacentes. Para além disso, uma elevada expressão proteica de RAB11A e RAB11B está positivamente correlacionada com a capacidade invasiva de diferentes linhas celulares de cancro da mama. Constatámos que a sobreexpressão das isoformas da RAB11 não promove a invasão em esferóides formados por uma linha celular de CDIS. No entanto, a sobreexpressão da RAB11A aumenta a proliferação desta linha celular, sugerindo que esta isoforma desempenha um papel importante durante os estádios iniciais da formação do cancro da mama. Embora a RAB11A e RAB11B não regulem a transição de CDIS para CDI, observámos que o silenciamento de cada isoforma inibe a proliferação, bem como a migração singular e coletiva numa linha celular de cancro da mama triplo-negativo altamente invasiva. Para além disso, o silenciamento da RAB11A e RAB11B inibe a invasão de esferóides formados com esta linha celular. Curiosamente, as isoformas da RAB11 regulam a formação e atividade de invadopódios, que são estruturas envolvidas na degradação proteolítica da matriz extracelular. Adicionalmente, a RAB11A e RAB11B regulam a transição epitelial-mesenquimal através da modulação dos níveis de mRNA de SNAIL e SLUG. Por fim, também observamos uma diminuição na ativação da via de sinalização PI3K/AKT, aquando do silenciamento de cada isoforma. Tem sido demonstrado que os invadopódios são necessários para o intravasamento e extravasamento de células cancerígenas durante a metastização. Portanto, a inibição dos mecanismos que promovem a formação e atividade dos invadopódios pode constituir uma estratégia promissora para impedir o desenvolvimento de metástases em qualquer fase da doença. Desta forma, propomos a RAB11A e RAB11B como potenciais alvos terapêuticos para prevenir a formação de metástases.