Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa Tese de Doutoramento Ciências da Saúde 2023

Abstract The discovery of reprogramming methods able to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from adult somatic tissues was an outstanding breakthrough in the field of personalized cell-based regenerative medicine therapies. This was due both to their self-renewal capacities and their potential to differentiate into almost any cell type. Since then, these cells have been used in numerous studies, with the major focus being on disease modeling and drug screening, which can be done using patient-specific iPSCs. However, several limitations still affect the possibility of applying iPSC based technology for therapeutic purposes, one of which is the possibility of teratoma formation upon allografting of iPSCs or differentiated cells derived from them. In an optimal scenario, the perfect stem cell-based therapy would deliver/replenish a single cell type or progenitor type, and include the possibility to eliminate all other undesired or unnecessary cell types derived from the allografted stem cell. This scenario could be achieved if we had a versatile cell-type selection system that eliminates all allografted cells except our cell of interest. In order to distinguish specific cell types genetically, we can explore the transcriptional program of the cells, which reflects, at the most basic level, a unique combination of binary ON/OFF states of the regulatory elements present in their genome. The expression of these regulatory elements can be combined using intersectional genetics approaches to specifically identify a particular cell type. In this work, we developed tools to create a cell-selection system that can be used following iPSC-based therapies to select (i.e., allow the survival of) a single desired cell type derived from these iPSCs. For this, we generated an inducible cell-ablation system based on the Tet-On technology, and an intersectional genetics-based cell-type selection cassette, which produces an “antidote” against the cell-ablation system specifically in the cell of interest. For the cell-ablation system, we tested both a CRISPR/Cas9-based approach and an iCasp9-based approach, with the latter being more successful than the former. These cell-ablation systems were placed under the control of a TRE promoter, which is activated by a synthetic rtTA transcription factor in the presence of doxycycline. The antidote consists of a custom-engineered TetR*-KRAB protein, which binds to the TRE promoter independently of Doxycycline, efficiently competing with rtTA, thus preventing cell ablation. So that the TetR*-KRAB protein antidote could be driven specifically in the desired target cell using intersectional genetics, it was split into 2, 3, or 4 non-self-complementing components. Its modularity was tested by expressing the components constitutively or via cell-type specific promoter and enhancer combinations. As a proof-of-principle, we tested each component of the cell-ablation system and the TetR*-KRAB and its split forms in human HEK293T cells using constitutive promoters. For cell type specific selection, we tested iPSC and neural stem cell (NSC)-specific enhancers to guide the expression of the TetR*-KRAB in these cells. The four NSC regulatory elements that were tested led to a downregulation of the TRE promoter, showing the potential protective function of TetR*-KRAB in preventing the cell-ablation cassette activation. This system or its future derivatives can be used for selection of desired cell types during differentiation protocols or organoid cultures and even as a security measure upon future cell therapies using iPSCs or differentiated cells derived from them.

Resumo A descoberta de métodos de reprogramação capazes de gerar células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de tecidos somáticos adultos foram um avanço notável no campo das terapias de medicina regenerativa personalizada baseadas em células, devido à sua capacidade de auto-renovação e potencial para se diferenciarem em qualquer célula proveniente do tecido embrionário. Desde então, estas células têm sido usadas em múltiplos estudos, com uma maior ênfase em modelação de doenças e ensaios de medicamentos, que podem ser realizados com células especificamente derivadas de doentes. No entanto, diversas limitações afetam ainda a possibilidade de se usarem as tecnologias baseadas em iPSCs para fins terapêuticos, sendo uma delas a possibilidade de geração de teratomas após a transplantação das iPSCs ou de células delas diferenciadas. Num cenário ideal, a terapia perfeita baseada em células estaminais entregaria/reabasteceria apenas um tipo celular ou os seus progenitores e incluiria a possibilidade de eliminar todos os outros tipos celulares indesejados ou desnecessários derivados das células estaminais transplantadas. Este cenário poderia ser alcançado se tivéssemos um sistema de seleção de tipo celular versátil que eliminasse todas as células transplantadas exceto as células de interesse. De forma a distinguir geneticamente tipos celulares específicos, podemos explorar o programa transcricional das células que reflete, no nível mais básico, uma combinação binária ON/OFF única do estado dos elementos regulatórios presentes no seu genoma. A expressão destes elementos regulatórios pode ser combinada usando uma abordagem da genética interseccional para identificar especificamente um tipo celular em particular. Neste trabalho, desenvolvemos ferramentas para criar um sistema de seleção celular que pode ser usado após terapias baseadas em iPSCs para selecionar (ou seja, permitir a sobrevivência de) apenas um tipo celular desejado derivado dessas iPSCs. Para isso, gerámos um sistema induzível de excisão celular baseado na tecnologia Tet-On e um sistema de seleção do tipo celular baseado em genética interseccional que produz um “antídoto” contra o sistema de excisão celular. Para o sistema de excisão celular, testámos tanto uma abordagem baseada no sistema CRISPR/Cas9 como uma abordagem baseada na iCasp9, com a segunda com uma resposta mais eficaz que o primeiro. Estes métodos de excisão celular foram colocados sob o controlo de um promotor TRE, que é ativado por um factor de transcrição sintético rtTA na presença de doxiciclina. O antídoto é uma proteína TetR*-KRAB personalizada, que se liga ao promotor TRE independentemente de doxiciclina, que compete eficientemente com rtTA, assim prevenindo a excisão celular. Para que o antídoto proteico TetR*-KRAB possa ser guiado especificamente para o alvo celular desejado usando uma abordagem da genética interseccional, este foi dividido em 2, 3 ou 4 componentes não auto-complementares. A sua modularidade foi testada expressando os componentes constitutivamente ou através de combinações de promotores e enhancers próprios para tipos celulares específicos. Para demonstrar a sua eficácia, cada componente do sistema de excisão celular e o antídoto proteico TetR*-KRAB e as suas formas divididas foram testadas usando promotores constitutivos em células HEK293T. Para a selecção específica de um tipo celular, testámos a capacidade de enhancers específicos de iPSCs e de células estaminais neurais (NSCs) guiarem a expressão de TetR*-KRAB nestas células. Os quatro elementos regulatórios de NSCs que foram testados levaram a uma diminuição da expressão do promotor TRE, demonstrando a potencial função protetiva do TetR*-KRAB em prevenir a ativação do sistema de excisão celular. Este sistema ou derivados futuros poderão ser usados para selecionar tipos celulares desejados durante protocolos de diferenciação ou cultura de organóides, e mesmo como uma medida de segurança em futuras terapias celulares usando iPSCs ou células delas diferenciadas