Tese de Doutoramento Biomedicina 2023 Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa

ABSTRACT Learning is a key process allowing individuals to adapt to the environment. It is now well accepted that information stored in the form of long-term memories (LTM) involves a process of consolidation, in which labile memories are stabilized as longlasting traces. Although one can consider each learning event as the acquisition of a “new” memory, considerable evidence indicates that new memories are formed in an interleaved fashion upon a large network of pre-existing knowledge. This implies that learning is highly influenced by previous experience and that previously consolidated memories can be reactivated during new learning. Once active, a previously acquired memory can be strengthened by the following event, by cooperation, or can be lost, by competition. The rules by which memory cooperation and competition are orchestrated and what determines which trace is stored as longterm memory, are completely unknown. To tackle these questions, we have studied the rules of synaptic cooperation and competition in the lateral amygdala (LA). The LA circuitry is very well characterized from the anatomical and behavioural point of view, with the possibility of linking cellular physiology with behaviour. We found that cortical and thalamic inputs into the amygdala engage in synaptic cooperation leading to the maintenance of transient forms of long-term potentiation (LTP) induced by either weak stimulation of thalamic or cortical synapses. Interestingly, the cooperation between cortical and thalamic inputs is bi-directional but asymmetric. We found that thalamic capture of plasticity-related proteins (PRPs) occurs in a time window that is much shorter than the cortical capture of PRPs. This suggests a restriction mechanism in thalamic cooperation, which we found to be due to an activity-dependent release of endocannabinoids. Cortical and thalamic synapses also engage in competition when the availability of PRPs is limited. Interestingly, inhibition of the endocannabinoid signaling favors competition. Additionally, we found that the time of thalamic and cortical activation is a crucial parameter for synaptic cooperation and competition. Our current hypothesis is that endocannabinoid signaling controls negatively the thalamic activity limiting the time of association with the cortical activation. Thalamic time restriction can be particularly relevant in the acquisition of discriminative forms of fear-learning. To test this hypothesis, we developed a behaviour protocol designed to probe memory cooperation and competition. Animals were exposed to two auditory stimuli one unpaired (CS-) and one paired with a footshock (CS+) separated by different time intervals. In our paradigm, during training, each stimulus is presented in blocks, in two different contexts representing two different events. We found, similarly to what we described at the synaptic level, that animals’ associate events if the time interval is less than 30 minutes, showing that memory cooperation follows the same temporal rule as synaptic cooperation. Interestingly, we also found that introducing a third stimulus, during training induces a form of memory competition that destabilizes the acquisition of a fear response to both events. Memory competition is also sensitive to the time at which the third stimulus is introduced. Taken together, we found that memory cooperation and competition follow the same temporal rules as synaptic competition in the lateral amygdala. It remains to be explored whether the same rules apply to remote versus recent events and whether different sensory modalities and/or neuronal circuits show different temporal rules.

RESUMO A aprendizagem é um processo chave na adaptação dos indivíduos ao ambiente. Actualmente sabe-se que a informação armazenada na forma de memórias de longo prazo (LTM) envolve um processo de consolidação, no qual as memórias “voláteis” são estabilizadas como “traços” de longa duração. Embora se possa considerar cada evento de aprendizagem como a aquisição de uma “nova” memória, várias evidências indicam que as novas memórias são formadas de forma intercalada sobre uma grande rede de conhecimento pré-existente. Isso implica que a aprendizagem seja altamente influenciada pela experiência anterior e, que memórias previamente consolidadas possam ser reativadas durante a nova aprendizagem. Uma vez ativa, uma memória previamente adquirida pode ser fortalecida pelo evento seguinte, por cooperação, ou pode ser perdida, por competição. As regras pelas quais a cooperação e a competição de memórias são orquestradas e o que determina qual é o “traço” que é armazenado como memória de longo prazo são completamente desconhecidos. De forma a resolver estas questões, estudámos as regras de cooperação e competição sináptica na amígdala lateral. O circuito da amígdala está muito bem caracterizado do ponto de vista anatómico e comportamental, oferecendo a possibilidade de vincular a fisiologia celular ao comportamento. Descobrimos que as projecções corticais e talâmicas na amígdala interagem através de mecanismos de cooperação sináptica, levando à manutenção de formas transitórias de potenciação de longo prazo (LTP) induzidas por estimulação fraca de sinapses talâmicas ou corticais. Curiosamente, a cooperação entre as projecções corticais e talâmicas é bidirecional, mas assimétrica. Por outro lado, descobrimos que a captura de proteínas relacionadas com a plasticidade (em inglês: “plasticity-related proteins – PRPs”), por parte da projecção talâmica, ocorre numa janela temporal muito menor do que a captura cortical de PRPs. Estes resultados sugerem um mecanismo de restrição na cooperação talâmica, o qual se deve a uma liberação dependente da atividade de endocanabinóides. Por outro lado, as sinapses corticais e talâmicas também interagem através de mecanismos de competição quando a disponibilidade de PRPs é limitada. Neste caso, a inibição da sinalização dos endocanabinóides favorece a competição. Para além disso, descobrimos que o tempo de ativação talâmica e cortical é um parâmetro crucial para a cooperação e competição sinápticas. A nossa hipótese atual é que a sinalização através dos endocanabinóides controla negativamente a atividade talâmica, limitando o tempo de associação. A restrição de tempo talâmica pode ser particularmente relevante na aquisição de formas discriminativas de aprendizagem pelo medo. Para testar essa hipótese, desenvolvemos um protocolo de comportamento projetado para estudar a cooperação e a competição entre memórias. Os animais foram expostos a dois estímulos auditivos, um não emparelhado (CS-) e outro emparelhado com um choque (CS+), separados por diferentes intervalos de tempo. No nosso modelo, durante o treino, cada estímulo é apresentado em blocos em dois contextos diferentes, representando dois eventos diferentes. À semelhança do que descrevemos ao nível sináptico, descobrimos que os animais associam eventos se o intervalo de tempo for inferior a 30 minutos, mostrando que a cooperação de memórias segue a mesma regra temporal que a cooperação sináptica. Curiosamente, também descobrimos que a introdução de um terceiro estímulo, durante o treino, induz uma forma de competição de memória que desestabiliza a aquisição de uma resposta ao medo a ambos os eventos. Mais ainda, a competição de memória também é sensível ao momento em que o terceiro estímulo é introduzido. Em suma, mostrámos que a cooperação e a competição de memória seguem as mesmas regras temporais que a competição sináptica na amígdala lateral. No futuro, será interessante explorar se as mesmas regras se aplicam a eventos remotos versus eventos recentes e se diferentes modalidades sensoriais e/ou circuitos neuronais apresentam diferentes regras temporais