Tese de Doutoramento Mecanismos de Doença Regenerativa 2023 Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa

ABSTRACT Exosomes are a subtype of extracellular vesicles (EVs) of endocytic origin that have been the subject of intense research in the last 2 to 3 decades. Exosomes are part of a complex intercellular and inter-organ communication network, transporting and delivering nucleic acids, proteins and other biomolecules between cells. Exosomes have generated considerable interest as evidence demonstrate that they not only have paracrine and endocrine signalling capabilities, but also mediate cellular re-programming and multicellular coordination in several tissues and organs, participating in events such as the immune response, tumour progression and metastasis and neurodegeneration. However, we are still far from fully understanding the impact of exosomes in metazoans biology. Previously, we had described a mechanism for the loading of proteins into exosomes that relied in the lysosomal associated protein 2 isoform A (LAMP2A). This mechanism requires the presence, on the protein to be loaded, of a specific pentapeptide sequence, or ExoSignal, that is recognized by HSC70 in the cytosol and LAMP2A at the endosomal limiting membrane. With this work we now show that the exosomal Loading of Cargo (eLLoC) triages and loads proteins into a subpopulation of exosomes. This mechanism is ESCRT- independent and involves additional molecular players such as CD63, Syntenin-1, ALIX, RAB31 and the lipid ceramide. Furthermore, using the zebrafish as a model and by tagging fluorescent proteins with the ExoSignal we were able to follow inter-organ transfer of exosomes. Our findings identify eLLoC as a key mechanism in exosome biogenesis while in vitro and in the zebrafish, while providing new tools for exosome engineering in the pursuit for innovative therapeutic strategies.

RESUMO Os exossomas são um subtipo de vesículas extracelulares (EV) de origem endocítica que têm sido alvo de intensa investigação nas últimas 2 a 3 décadas. Os exossomas fazem parte de uma complexa rede de comunicação intercelular e entre órgãos, transportando e distribuindo ácidos nucleicos, proteínas e outras biomoléculas entre as células. Os exossomas têm gerado muito interesse, pois as evidências demonstram que eles não só possuem capacidades de sinalização parácrina e endócrina, como também regulam a reprogramação celular e a coordenação multicelular em vários tecidos e órgãos, participando de eventos como a resposta imune, progressão tumoral e metástase e neurodegeneração. No entanto, ainda estamos longe de entender completamente o impacto dos exossomas na biologia dos metazoários. Anteriormente, descrevemos um mecanismo para o carregamento de proteínas em exossomas que dependiam da isoforma A da proteína 2 associada aos lisossomas (LAMP2A). Este mecanismo requer a presença, na proteína a ser carregada, de uma sequência específica de pentapeptídeos, ou ExoSignal, que é reconhecida por HSC70 no citosol e LAMP2A na membrana endossomal limitante. Com este trabalho, agora mostramos que o carregamento de carga exossomal (“Exossomal Loading of Cargo”, eLLoC), que faz a triagem e carrega proteínas numa subpopulação de exossomas. Este mecanismo é independente da maquinaria do ESCRT e envolve agentes moleculares adicionais, como CD63, Syntenin-1, ALIX, RAB31 e o lípido ceramida. Além disso, usando o peixe-zebra como modelo e marcando proteínas fluorescentes com o ExoSignal, conseguimos acompanhar a transferência de exossomas entre órgãos. As nossas descobertas identificam o eLLoC como um mecanismo-chave na biogénese de exossomas in vitro e no peixe-zebra, ao mesmo tempo em que fornece novas ferramentas para a engenharia de exossomas na procura de estratégias terapêuticas inovadoras