Dissertação de Mestrado Investigação Biomédica 2024 Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa

Abstract Abnormal synaptic physiology is linked to several neurological disorders. Numerous synaptopathies result from defects in the presynaptic compartment, but the exact mechanisms remain poorly understood. Synaptic boutons are conserved presynaptic specializations where synapses assemble and are considered hallmarks of functional synapses. The complexity of axonal branching and the density of synaptic boutons can vary depending on the specific neural circuits in which neurons are engaged. Even slight alterations in bouton number and size can affect the neuronal circuitry and function. These changes are typically linked to plasticity processes, which facilitate the remodeling and alterations of morphology to align with the demands of neuronal activity. Bouton defects may also serve as indicators of neuronal dysfunction. Recent findings at the Drosophila melanogaster neuromuscular junction have strengthened the idea that neuronal plasticity seems to be tightly regulated by trans-synaptic signaling, namely through physical interactions between the neurons and their surrounding cells, such as the muscle, and possibly glial cells. Neuronal confinement seems to be a key player in synaptic plasticity through the modulation of bouton genesis by pressure-driven mechanisms, such as blebbing. The same relationship in the mammalian brain has been observed, in which high tension in the presynaptic domain appears to increase neurotransmission. If mechanical force generated by neuronal neighboring cells is involved in the regulation of neuronal structure, and given the obvious lack of muscle in the brain, glial cells appear as one of the strongest candidates to promote external mechanical tension and modulate neuronal morphology through glia-neuron physical interactions. Specifically, astrocytes, the most abundant type of glial cells in the human brain, are highly dynamic entities, allowing them to closely engage with synapses during periods of increased activity. While their molecular functions within synapses have been well-defined, their physical interactions, especially with the presynaptic domain, remain poorly understood. To test the hypothesis of whether astrocytes play a mechanical role in neuronal morphology, we used two distinct models in this study: Drosophila and human-derived neurospheroids. With Drosophila, and its vast genetic tools, we demonstrated that astrocytic contractility may play a role in presynaptic morphology, namely trough the precise regulation of astrocytic structural plasticity due to non-muscle myosin II activity. In parallel, we used human-derived neurospheroids as a complementary model to extend and apply these findings in a more human-relevant context. For our initial approach, we conducted a thorough characterization of the neuronal populations and neuron-astrocyte interactions in this model, demonstrating their close resemblance to the human brain. Our data encourages future endeavours to replicate the findings observed in the fruit fly brain in a human-like environment, given the opportunity to conduct similar approaches in both models. This knowledge will contribute to a better understanding of how neuronal structure and function can be influenced by extrinsic factors such as mechanical force or extracellular stiffness, therefore opening new avenues to explore therapeutical approaches for the treatment of several neurological disorders.

Resumo Alterações na fisiologia sináptica estão associadas a várias doenças do foro neurológico. Várias sinaptopatias resultam de defeitos no compartimento pré-sináptico, mas os mecanismos por subadjacentes a estes problemas ainda não são completamente conhecidos. Botões sinápticos são especializações pré-sinápticas evolucionariamente conservadas onde as sinapses são formadas. Assim, botões sinápticos são considerados característicos de sinapses funcionais. A complexidade dos axónios e a abundância dos botões sinápticos depende dos circuitos neuronais nos quais os neurónios envolvidos. Alterações no número e no tamanho dos botões, mesmo que ligeiras, são suficientes para afetar circuitos neuronais e a atividade destas redes neuronais. A regulação do número de botões está associada a processos de plasticidade sináptica, que facilita a remodelação e a alteração da morfologia dos neurónios para corresponder às necessidades da atividade neuronal. Assim, os botões também podem servir como indicadores de disfunção neuronal. Estudos recentes na junção neuromuscular da Drosophila reforçaram a ideia de que a plasticidade neuronal parece ser fortemente regulada por sinalização trans-sináptica, nomeadamente através de interações físicas entre os neurónios e as células circundantes, como as do músculo, e possivelmente as da glia. O confinamento neuronal parece ser um fator-chave na plasticidade sináptica, regulando a formação de botões através de mecanismos de pressão, como “blebbing”. A mesma relação foi observada no cérebro de mamíferos, onde o aumento da tensão no domínio pré-sináptico parece intensificar a neurotransmissão. Se a força mecânica gerada pelas células vizinhas dos neurónios estiver envolvida na regulação da estrutura neuronal, e dada a óbvia ausência de músculo no cérebro, as células da glia parecem ser fortes candidatas a promover tensão mecânica exterior aos neurónios e a influenciar a morfologia neuronal, através das suas interações físicas. Em particular, os astrócitos, o tipo de glia mais abundante no cérebro humano, que sendo entidades altamente dinâmicas, o que lhes permite envolverem-se intimamente com as sinapses durante períodos de maior atividade, são bons candidatos para mediar plasticidade neuronal por compressão direta dos terminais axonais dos neurónios. Embora as suas funções moleculares nas sinapses estejam bem definidas, as suas interações físicas, especialmente com o domínio pré-sináptico, continuam por compreender. Para testar a hipótese de que os astrócitos desempenham um papel mecânico na regulação da morfologia neuronal, utilizámos dois modelos distintos neste estudo: Drosophila e neuroesferóides de células humanas. Com Drosophila, e aproveitando as suas vastas ferramentas genéticas, demonstrámos que a contratilidade dos astrócitos pode desempenhar um papel na morfologia pré-sináptica, nomeadamente através da regulação precisa da plasticidade estrutural destas células, devido à atividade da miosina, não muscular, II. Em paralelo, utilizámos neuroesferóides como modelo complementar para alargar e aplicar estes resultados num contexto mais relevante para o ser humano. Numa abordagem inicial, efetuámos uma caraterização minuciosa das populações neuronais e das interações neurónio-astrócitos neste modelo, demonstrando a sua grande semelhança com o cérebro humano. Os nossos dados apoiam um modelo onde as observações feitas no cérebro da mosca da fruta têm algum potencial para ser informativas para estudos feitos num ambiente semelhante ao humano, dada a capacidade de se aplicar abordagens semelhantes em ambos os modelos. Este conhecimento contribuirá para uma melhor compreensão de como a estrutura e a função neuronal podem ser influenciadas por fatores extrínsecos, como a força mecânica ou a rigidez extracelular, abrindo assim novas oportunidades para explorar abordagens terapêuticas para o tratamento de várias doenças neurológicas