Dissertação de Mestrado Investigação Biomédica 2023 Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa

Abstract Due to the end-replication problem, normal somatic cells gradually shorten their telomeres at each cell division. This progressive shortening eventually triggers a DNA damage response (DDR), cellular senescence or apoptosis. Cancer cells must counteract telomere shortening to enable continuous cell division. These cells can elongate their telomeres by reactivating telomerase or by homology-directed repair (HDR) mechanisms, called Alternative Lengthening of Telomeres (ALT). ALT cells have distinct molecular features, such as accumulation of telomeres at ALT-associated PML bodies (APBs), and abundant extrachromosomal telomeric repeats (ECTRs) that includes partially single-stranded circles (C- and G-circles). ALT cancers perpetuate telomere maintenance based on telomeric replication stress and HDR pathways. This ALT-specific Telomeric Replication Stress (ATRS) must be carefully regulated, otherwise, it can result in cell cycle arrest and death when in excess. However, the full nature of the mechanisms underlying the response to exacerbated ATRS remains elusive. Preliminary data in the Azzalin lab showed that induction of ATRS by depletion of FANCM, a replication stress alleviator, results in the recruitment of several proteins to ALT-telomeric DNA, among them ESCRT-III proteins. Here, I explore the involvement of two subunits of the ESCRT-III complex, CHMP4B and CHMP7 in the response to telomeric replication stress in ALT cancer cells. In this work, I confirmed that both CHMPs are involved in the regulation of telomeric replication stress in ALT and telomerase-positive cells (U2OS and HOS, respectively). The findings show that CHMP4B and CHMP7 act as suppressors of ATRS and are not essential for cell cycle progression in U2OS. When CHMP4B and CHMP7 are depleted in U2OS, ATRS increases and, consequently, APB formation is induced. On the other hand, no alterations in C-circles levels are detected upon loss of CHMP4B and CHMP7, but the distribution of C-rich telomeric single-stranded DNA within the cytoplasm and the nucleus is perturbed. Thus, I propose that ESCRT-III complex may facilitate the clearance of by-products of telomere elongation from the nucleus, such as C-circles. On the other hand, CHMP4B induces telomeric replication stress in HOS cells through a mechanism that remains unidentified. Nevertheless, CHMP4B has a dual role towards telomeric replication stress depending on the existing telomere maintenance mechanism. Overall, these results suggest that CHMP4B and CHMP7 are implicated in the regulation of telomeric replication stress in ALT cells. Further studies should focus on elucidating the precise mechanisms through which CHMP4B and CHMP7 contribute to the regulation of telomeric replication stress in ALT and telomerase-positive cancer cells.

Resumo Devido à incapacidade de replicar as extremidades dos cromossomas, as células somáticas normais diminuem gradualmente os seus telómeros em cada divisão celular. Este encurtamento progressivo desencadeia eventualmente uma resposta de dano do DNA, senescência ou morte celular. As células cancerígenas têm de contrariar o encurtamento dos telómeros para garantir a contínua divisão celular. Estas células podem alongar os seus telómeros reativando a enzima telomerase ou por mecanismos de reparação dirigida por homologia (HDR), denominados por Alongamento Alternativo dos Telómeros (ALT). As células ALT apresentam distintas características moleculares, nomeadamente, acumulação de telómeros em corpos de PML (APBs) e abundantes espécies de DNA extracromossómicas de repetições teloméricas (ECTRs), como por exemplo, círculos de DNA parcialmente de cadeia simples (C- e G-circles). Os cancros ALT perpetuam a manutenção dos telómeros através de stress replicativo nos mesmos e de recombinação homóloga. O stress replicativo nos telómeros específico das células ALT (ATRS) tem de ser rigorosamente regulado, caso contrário, quando em excesso, pode resultar numa interrupção do ciclo celular e morte celular. Porém, a natureza dos mecanismos subjacentes à resposta de ATRS exacerbado ainda não é inteligível. Dados preliminares do laboratório Azzalin demostraram que a indução de ATRS pela depleção de FANCM, um mitigador do stress replicativo, resulta no recrutamento de diversas proteínas para o DNA telomérico das células ALT, entre as quais, as proteínas ESCRT-III. Deste modo, no presente projeto, eu exploro o envolvimento de duas subunidades do complexo ESCRT-III, CHMP4B e CHMP7, na resposta ao stress replicativo nos telómeros em células ALT. Neste trabalho, eu confirmei que as duas CHMPs estão envolvidas na regulação do stress replicativo dos telómeros em células ALT e em células telomerase-positivas (U2OS e HOS, respetivamente). Os resultados evidenciaram que tanto a CHMP4B como a CHMP7 atuam como supressores de ATRS e não são essenciais para a progressão do ciclo celular nas células U2OS. Quando CHMP4B e CHMP7 são removidas das U2OS, o ATRS aumenta e, consequentemente, a formação de APBs é induzida. Por outro lado, não são detetadas alterações nos níveis de C-circles com a perda de CHMP4B e CHMP7, mas a distribuição de moléculas de DNA telomérico de cadeia simples ricas em citosinas (C-rich) no citoplasma e no núcleo é perturbada. Assim, proponho que o complexo ESCRT-III possa facilitar a eliminação de subprodutos do alongamento telomérico presentes no núcleo, como C-circles. Por outro lado, a proteína CHMP4B induz stress replicativo nos telómeros em células HOS através de um mecanismo que permanece desconhecido. Assim, a proteína CHMP4B tem um duplo papel no stress replicativo nos telómeros, dependendo do mecanismo de manutenção telomérica existente na célula. Em suma, estes resultados sugerem que CHMP4B e CHMP7 estão implicados na regulação de ATRS nas células ALT. Investigações futuras devem incidir nos mecanismos nos quais CHMP4B e CHMP7 contribuem para a regulação do stress replicativo nos telómeros em células cancerígenas ALT e telomerase-positivas