Dissertação de Mestrado Investigação Biomédica 2023 Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa

Abstract Synaptic plasticity is a process by which neurons remodel their structure and/or molecular composition of synapses. This mechanism underlies nervous system connectivity and allows for cognition and memory formation. The Drosophila peripheral nervous system has been extensively used to characterize mechanisms of plasticity. The peripheral nerves are wrapped by three glial layers: the innermost wrapping glia (WG), middle layer of subperineurial glia (SPG) and the outermost perineurial glia (PG). The SPG and PG subtypes extend multiple membranous processes (namely lammelipodia-like structures, gliopods and gliobuls) into the larval neuromuscular junctions (NMJs). The NMJ synapse is established between motor neuron presynaptic terminals that innervate muscle cells and enables robust analysis of activity-induced structural plasticity. On motor terminals of 3rd instar NMJs, new boutons are added to the existing NMJ in response to developmental cues and in an activity-dependent manner. New boutons can be induced acutely through stimulation protocols based on patterned high K+ stimulation, or chronically by raising larvae at 290C, which increases larval locomotion and therefore activity. SPG at the NMJ has been previously shown to participate in bouton formation by releasing a synaptogenic cue, and to clear shed neuronal membrane which also impacts bouton formation. PG on the other hand have been hypothesized to respond to neuronal activity and match neuronal growth induced by chronic temperature raising (Tstim). Despite the efforts to characterize glial contributions to activity-dependent plasticity at the NMJ, some questions remain unanswered, such as can both SPG and PG sense activity at the NMJ? Does glia respond to activity with specific morphological changes? Are there specific types of glial protrusions involved in activity-dependent bouton formation? What mechanisms govern the formation these glial membranous structures? Do glial subtypes have redundant or synergetic roles at the NMJ? To address these questions, we subjected larvae with membrane labelled SPG and PG to acute and chronic activity protocols of stimulation. Our results are still preliminary but suggest that glial area does not change significantly after the induction of activity protocols to the NMJ. Nevertheless, both PG and SPG responded to Tstim with changes in the frequency of distinct membranous processes. Interestingly, we observed processes in very close contact with non-mature presynaptic ghost boutons but the relevance of this is still elusive. In unstimulated controls, we observed gliopods from both SPG and PG juxtaposed to ghost boutons. To further understand how glial subtypes interact between themselves, we did dual labelling of SPG and PG and observed processes of these glia do not always extend towards the same location, suggesting that they may be sensing different cues. We performed in vivo live imaging of labelled glia and observed that glial protrusions are dynamic and show differential calcium levels throughout the processes. Overall, our results suggest that SPG and PG adapt to chronically induced neuronal growth and activity and that possible local calcium dynamics exist within SPG processes after stimulation. Our findings also suggest non-redundant roles for SPG and PG considering their morphologies are distinct within single NMJs. Our results also suggest that gliopods from SPG and PG can modulate presynaptic structural plasticity given their close proximity with ghost boutons. Further understanding glial dynamics and intercellular communication at the NMJ will probably elucidate the mechanisms governing activity-dependent plasticity.
Resumo A plasticidade sináptica é um processo através do qual os neurónios remodelam a sua estrutura e/ou a composição molecular das sinapses. Este mecanismo está na base da conetividade do sistema nervoso e processos como a formação de memória e cognição. O sistema nervoso periférico da Drosophila tem sido amplamente utilizado para caraterizar os mecanismos de plasticidade. Os nervos periféricos são envolvidos por três camadas gliais: a glia envolvente mais interna (WG), a camada média da glia subperineural (SPG) e a glia perineural mais externa (PG). Os subtipos SPG e PG estendem múltiplos processos membranosos (nomeadamente estruturas semelhantes a lammelipódios, gliopodes e gliobulbs) para as junções neuromusculares (NMJ) das larvas. A NMJ é uma sinapse estabelecida entre os terminais pré-sinápticos dos neurónios motores e o músculo e permite uma análise robusta da plasticidade estrutural induzida pela atividade. Nos terminais motores das NMJ das larvas 3º instar, são adicionados novos botões à NMJ existente em resposta a sinais de desenvolvimento e de uma forma dependente da atividade. Os novos botões podem ser induzidos de forma aguda através de protocolos de estimulação baseados na estimulação padronizada com K+ elevado, ou de forma crónica através da elevação das larvas a 290C, o que aumenta a locomoção das larvas e, consequentemente, a sua atividade. Foi demonstrado anteriormente que as SPG na NMJ participam na formação de botões através da libertação de sinais sinapto génicos, e também participam na eliminação de resíduos de membrana dos neurónios, o que também tem impacto na formação de botões. Por outro lado, as PGs têm a hipótese de responder à atividade neuronal e corresponderem ao crescimento neuronal induzido pelo aumento crónico de 290C. Apesar dos esforços para caraterizar as contribuições da glia para a plasticidade dependente da atividade na NMJ, algumas questões permanecem sem resposta, tais como se tanto os SPG como os PG podem sentir a atividade na NMJ? A glia responde à atividade com alterações morfológicas específicas? Existem tipos específicos de protrusões gliais envolvidas na formação de botões dependentes da atividade? Que mecanismos regem a formação destas estruturas membranosas gliais? Os subtipos de glia têm papéis redundantes ou sinergéticos na NMJ? Para responder a estas questões, submetemos larvas, com SPG e PG marcadas, a protocolos de estimulação de atividade aguda e crónica. Os nossos resultados são ainda preliminares, mas sugerem que a área glial não se altera significativamente após a indução de protocolos de atividade para a NMJ. No entanto, tanto a PG como a SPG responderam a 290C Tstim com alterações na frequência de processos membranosos distintos. Curiosamente, observámos processos em contacto muito próximo com GB, mas a relevância desta observação ainda não é clara. Em controlos não estimulados, observámos gliopodes de SPG e PG justapostos a GBs. Para compreender melhor a forma como os subtipos de glia interagem entre si, fizemos uma marcação dupla de SPG e PG e observámos que os processos destas glias nem sempre se estendem para o mesmo local, sugerindo que podem estar a detetar sinais diferentes. Realizámos microscopia in vivo de glia marcada e observámos que as protrusões gliais são dinâmicas e apresentam níveis de cálcio diferenciados ao longo dos processos. No global, os nossos resultados sugerem que as SPG e as PG se adaptam ao crescimento e à atividade neuronal induzidos cronicamente e que existe uma possível dinâmica local do cálcio nos processos do SPG após a estimulação. Os nossos resultados também sugerem papéis não redundantes para SPG e PG, considerando que as suas morfologias são distintas em cada NMJ. Os nossos resultados também sugerem que os gliopodes de SPG e de PG podem modular a plasticidade estrutural pré-sináptica, dada a sua proximidade com GBs. Uma melhor compreensão da dinâmica glial e da comunicação intercelular na NMJ, ajudará a elucidar os mecanismos de plasticidade dependente da atividade neuronal